付世新，齊長學(xué)，羅春海，張 麗，王 瑤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319)

溶菌酶(lysozyme)作為天然非特異性抗菌物質(zhì)，廣泛分布于植物、動物和微生物中[1]。普遍存在于哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳汁、體液、組織細胞內(nèi)以及胎盤中。不僅具有殺菌作用，還具有增強免疫力、減緩炎癥[2]、促進組織修復(fù)[3]等多種功能。溶菌酶在細菌性疾病的防治過程中取得了較好的預(yù)防和治療效果，與抗生素相比顯示出療效高、無毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，成為研發(fā)抗生素替代制劑的熱點。

牛乳溶菌酶(LYZ1)作為c型溶菌酶中的一種，在治療奶牛子宮內(nèi)膜炎、乳房炎等細菌性疾病中不僅具有相似的生物學(xué)作用，還具有同源性的優(yōu)勢。因此，本研究通過畢赤酵母GS115分泌表達系統(tǒng)獲得了重組牛乳溶菌酶，與溶菌酶天然提取方法相比，克服其產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定和成本高等缺點，為溶菌酶的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 質(zhì)粒pPICZα-A與畢赤酵母菌株GS115購自Invitrogen公司；實驗用金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸埃希菌ATCC8099等標準菌株購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；無乳鏈球菌C55901、停乳鏈球菌C55935等標準菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乳房鏈球菌021-51082219購于北京早稻田生物科技發(fā)展有限公司；溶壁微球菌ATCC 4698購于Sigma公司。

1.2 主要試劑 T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、XbaⅠ、蛋白Marker購自TaKaRa公司；牛乳溶菌酶重組蛋白的單因子血清；山羊抗小鼠二抗為Promega公司產(chǎn)品；Zeocin為Invitrogen公司產(chǎn)品；人溶菌酶標品購自Merck公司；溶壁微球菌購于Sigma公司；His Trap FF粗提柱購于GE Healthcare公司。

1.3 目的序列的改造與引物合成 根據(jù)GenBank中登錄的LYZ1基因序列(NM-001077829)去除LYZ1基因前段18個氨基酸的信號肽，并按照畢赤酵母的偏愛密碼子改造目的序列。在不改變其氨基酸序列的前提下，更換為酵母偏愛密碼子共16個。人工合成的目的序列包含編碼溶菌酶130個氨基酸的基因全長序列(390 bp)，以及在目的序列前端添加限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切位點和編碼組氨酸標簽(His-tag)的6個氨基酸的18 bp，在目的序列末端添加了終止密碼子和限制性內(nèi)切酶XbaⅠ的酶切位點，全長423 bp。并連接到pBluescriptⅡSK(+)質(zhì)粒中，命名為pBS-LYZI。

pPICZα-A載體通用引物(5'AOX1：5'-GACTGG TTCCAATTGACAAGC-3'和 3'AOX1：5'-GCAAAT GGCATTCTGACATCC-3')、目的片段改造引物(RP1：5'-CTGAATTCCATCATCATCATCATCATAAG-3'和RP2：5'-TCTAGACTCGAGTTAAACACGGCAAC-3')改造的目的基因序列及以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 目的基因的克隆 以RP1、RP2為引物，以pBS-LYZ1為模版，對目的序列進行擴增，擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 50 s、50℃ 50 s、72℃50 s，共30個循環(huán)；72℃10 min。將擴增序列連接到pMD18-T載體上，測序。

1.5 重組表達質(zhì)粒pPICZα-A-LYZ1的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhaⅠ對載體pMD18-TLYZ1和酵母載體pPICZα-A進行雙酶切，利用T4連接酶將膠回收目的片段和載體片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，提取重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后測序。

1.6 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化 將經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化的重組質(zhì)粒pPICZα-A-LYZ1與畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞混勻后加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在電壓1.8 kV、電容25 μF、電阻200 Ω、電擊7.0 ms的電轉(zhuǎn)參數(shù)下(以載體pPICZα-A為陰性對照)完成電轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)于含Zeocin抗性的YPDS培養(yǎng)基上。

1.7 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定 在YPDS(Zeocin+)固體培養(yǎng)基上挑起單個菌落，在YPD培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。以玻璃珠法提取的酵母基因組為模版，采用表達載體pPICZα-A通用引物(5'AOX1、3'AOX1)對轉(zhuǎn)化子進行檢測；擴增條件為：94℃5 min；94℃60s、54℃60s、72℃70s，30個循環(huán)；72℃10min。

1.8 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達 將篩選到的陽性和陰性酵母菌按照1%的比例分別接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，按照2%的比例接種到10 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約20h至OD600nm達到5～6；室溫5000r/min離心5 min收集菌體重懸于50 mL(0.5%甲醇、pH5.0)BMMY培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)表達。28℃、200 r/min培養(yǎng)60 h，期間每24 h添加終濃度1%甲醇。60 h后8 000 r/min離心10 min，收集培養(yǎng)液上清。

1.9 重組牛乳溶菌酶LYZ1的western blot檢測收集的上清首先采用超濾管濃縮，再用甲醇-氯仿法濃縮，將收集的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳；應(yīng)用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，以牛乳溶菌酶重組蛋白的單因子血清為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗進行檢測。

1.10 重組牛乳溶菌酶LYZ1的純化與濃度的測定將發(fā)酵液上清過濾除菌，采用超濾管將上清2倍濃縮。并按照GE公司的操作手冊，用結(jié)合緩沖液平衡親和柱，將濃縮后的酵母上清過柱，用10個柱體積的清洗緩沖液清洗，最后用洗脫緩沖液洗脫帶His-tag的目標蛋白，并收集洗脫液。洗脫液4倍稀釋后通過SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果，測定洗脫液純化后目標蛋白的濃度。

1.11 重組牛乳溶菌酶LYZ1的活性檢測 參照文獻[4]的快速比濁法，用pH6.2的PBS將溶菌酶標準品配成活力為5 000 u/mL、4 000 u/mL、3 000 u/mL、2 000 u/mL、1 000 u/mL的標準液；用pH6.2的PBS將溶壁微球菌重懸至OD490nm為2的懸液。以陰性酵母菌株表達上清為空白對照，將不同濃度的標準液和陽性酵母菌株表達上清各取100 μL加入到酶標板中，之后加入100 μL菌懸液，37℃恒溫作用5 min后測其吸光度OD490nm。以標準液活性為縱坐標，吸光度OD490nm平均值為橫坐標繪制標準曲線，用線性回歸方程y=ax+b表示，并將測出的樣品吸光度平均值代入方程得出樣品的活性。

1.12 重組牛乳溶菌酶LYZ1的體外溶菌活性檢測將重組牛乳溶菌酶酵母表達上清和空載體誘導(dǎo)表達上清分別濃縮50倍，過濾后備用。將適量埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌分別加入滅菌并冷卻至40℃～50℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每平皿倒入15 mL培養(yǎng)基，凝固后打孔制成各菌株的固體培養(yǎng)基平板。以空載體表達上清為對照，每孔加入上清50 μL，置37℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌環(huán)直徑(去除孔直徑)，計算同一類菌株的平均抑菌直徑。

2 結(jié) 果

2.1 目的序列的改造 目的序列經(jīng)改造后，在序列末端添加了XbaⅠ的酶切位點，經(jīng)雙酶切鑒定并測序。結(jié)果表明序列與預(yù)期相符。

2.2 表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZα-A-LYZ1用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切后，出現(xiàn)了一條約430 bp的片段，大小與目的序列一致，經(jīng)測序后表明與預(yù)期相符。

2.3 重組酵母菌的鑒定 PCR鑒定結(jié)果表明：pPICZα-A轉(zhuǎn)化菌擴增出約600 bp的DNA片段；pPICZα-A-LYZ1轉(zhuǎn)化菌則擴增出約 1 000 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致。證明LYZ1基因已經(jīng)整合到酵母基因組中(圖1)。

2.4 誘導(dǎo)表達蛋白LYZ1的SDS-PAGE分析及western blot檢測 SDS-PAGE結(jié)果顯示重組菌pPICZα-A-LYZ1/GS115濃縮上清有一條明顯的16 ku左右的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。經(jīng)試驗篩選目的蛋白高表達重組酵母菌株GS115/pPICZα-A-LYZ1，確定最佳誘導(dǎo)時間為60 h，最佳誘導(dǎo)pH為5.0。重組菌GS115/pPICZα-A-LYZ1濃縮上清的western blot分析顯示，有一條16 ku左右的蛋白條帶(圖2)。

2.5 誘導(dǎo)表達蛋白LYZ1的純化及其濃度的測定確定最佳清洗緩沖液pH7.0，咪唑濃度為40 mM；洗脫緩沖液pH7.4，咪唑濃度為500 mM。經(jīng)過His-tag柱子純化后，能夠獲得純度較高的目的蛋白。經(jīng)測定誘導(dǎo)表達的重組蛋白濃度為218 mg/L。

2.6 誘導(dǎo)表達蛋白LYZ1的活性檢測 采用酶標儀快速比濁法測定標準曲線，顯示溶菌酶活性與吸光度OD490nm的線性回歸方程為y=-6 691.5×OD490nm+6371.1。同時對樣品進行了多個重復(fù)的檢測，其OD490nm值為0.521±0.00012。將樣品OD490nm平均值代入回歸方程可得出樣品溶菌酶溶液的活性為2 842 u/mL。再根據(jù)測定的重組蛋白濃度可計算出其比活性約為13 040 u/mg(圖 3)。

2.7 誘導(dǎo)表達蛋白LYZ1的體外抗菌活性檢測 抑菌試驗結(jié)果顯示，重組牛溶菌酶對埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌效果，而對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌抑菌效果較弱，空對照未出現(xiàn)抑菌環(huán)。結(jié)果如表1所示。

表1 重組LYZ1體外抗菌實驗檢測結(jié)果Table 1 Bacterial inhibition assay of recombinant LYZ1

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對溶菌酶研究的不斷深入，人們更多的傾向于使用微生物發(fā)酵和乳腺生物反應(yīng)器[5-6]的方法生產(chǎn)溶菌酶。乳腺生物反應(yīng)器旨在提高牛奶品質(zhì)，改良個體性狀，不適于規(guī)?；a(chǎn)。微生物發(fā)酵的方法不僅易于培養(yǎng)和操作，而且生產(chǎn)成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。溶菌酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達已有報道[7-8]，但由于該系統(tǒng)所表達的外源蛋白難以進行正確的翻譯后修飾加工，很大程度上影響了其活性；另外溶菌酶能夠引起工程菌自溶，因此在原核表達系統(tǒng)中多以包涵體的形式獲得重組蛋白，表達后需對產(chǎn)物進行復(fù)性和純化等處理，導(dǎo)致成本上升。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有真核細胞翻譯后修飾加工功能，遺傳性狀穩(wěn)定等諸多優(yōu)點[9-10]；另外該系統(tǒng)彌補了哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統(tǒng)操作復(fù)雜、表達水平低、表達不穩(wěn)定和生產(chǎn)成本高的缺陷[11-12]。

歐陽萍等在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達了可溶性的重組人溶菌酶，表達量在裂解上清中占58.3%，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用[8]。賈向志等將人溶菌酶基因克隆至酵母分泌型表達載體pPIC9K中，表達的目的蛋白約占培養(yǎng)上清總蛋白的47%[13]。本實驗應(yīng)用pPICZα-A分泌型載體，目的蛋白在表達后得到了進一步修飾加工，活性增強，更加接近于天然牛乳溶菌酶。同時在目的基因前端添加了組氨酸標簽，可簡化表達產(chǎn)物的分離純化過程[11]。另外本實驗特別選用了畢赤酵母的偏愛密碼子對目的序列進行了改造，可大大增加目的蛋白的表達量。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，影響目的蛋白表達量的因素很多，主要包括菌體密度、通氣量和培養(yǎng)基pH值等。其中pH值影響較大，經(jīng)過對各種影響條件的優(yōu)化，獲得了最佳反應(yīng)條件，最佳的pH為5.0。

呂爽等構(gòu)建的分泌型酵母表達質(zhì)粒pPIC9K-hLYZ，重組蛋白表達量約 198 μg/mL，活性為4 677.72 u/mL[14]。而本實驗構(gòu)建的牛乳溶菌酶畢赤酵母表達系統(tǒng)所表達的重組蛋白濃度為218 mg/L，活性為2 842 u/mL，比活性約為13 040.0 u/mg。體外抑菌試驗表明牛重組乳溶菌酶具有一定的抗菌作用，尤其是對金黃色葡萄球菌抗菌效果最好，其次是埃希氏大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和無乳鏈球菌。選用這些細菌主要是因為它們均為臨床上奶牛乳房炎及子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌，并且有望將該研究成果應(yīng)用于臨床對奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎的治療方面，即可抑制細菌生長，又可以增強牛體的免疫力，同時還能促進子宮內(nèi)膜的修復(fù)。本研究組將在以后的實驗中，優(yōu)化表達條件，提高表達量和抑菌效果，推進該研究成果工業(yè)化，尤其是在臨床治療和飼料生產(chǎn)中替代抗生素等方面做進一步的推廣和應(yīng)用。

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