倪宏波，宮大慶，姜海芳，周玉龍，郭 爽，王春仁

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

牛邊緣無漿體病(Bovine anaplasmosis)主要是由寄生于反芻動物紅細(xì)胞內(nèi)的邊緣無漿體(Anaplasma marginale)引起的一種蜱媒傳染病。A.marginale屬于立克次氏體目(Rickettsiales)、無漿體科(Anaplasmataceae)，無漿體屬(Anaplasma)，是一類專性寄生于脊椎動物紅細(xì)胞邊緣無固定形態(tài)的微生物[1]。Bovine anaplasmosis廣泛存在于世界各地，主要引起牛、羊、鹿等家畜發(fā)病，高產(chǎn)奶牛最易感，主要表現(xiàn)為貧血、黃疸、高熱、消瘦以及流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重者可引起死亡，犢牛多不引起死亡?？祻?fù)牛仍然攜帶病原體，而成為感染其它動物的傳染源[2]。這是一種危害性極為嚴(yán)重的全球性疾病，每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

對A.marginale的研究，主要針對病原學(xué)、診斷方法及新型疫苗三方面[4-6]。而關(guān)于A.marginale感染對牛血液生化指標(biāo)和血液流變學(xué)的影響方面的研究尚屬空白。本研究旨在建立A.marginale人工感染動物模型，并揭示在病原體感染過程中牛血液生化指標(biāo)和血液流變學(xué)的變化規(guī)律，為進(jìn)一步開展該病發(fā)病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 陽性血液樣品 采集自齊齊哈爾市某牛場，經(jīng)PCR鑒定為A.marginale陽性的抗凝血液，冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 1月齡犢牛5頭，健康無其他疾病，雄性，分別編號為1號～5號。

1.3 主要試劑和儀器 地塞米松磷酸鈉注射液1mL∶5 mg購自河南前鋒藥業(yè)科技有限公司；瑞特氏原液、姬姆薩工作液、3.8%檸檬酸鈉溶液、血清生化檢測試劑盒均購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；ECOM-F6124半自動生化分析儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；LG-R-80A全自動血液粘度測試儀、LG-E&H-20通道動態(tài)血沉/壓積測試儀、LG-B-190型紅細(xì)胞變形聚集測試儀均為北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 人工感染方法 犢牛按常規(guī)方式飼養(yǎng)，1號牛用于A.marginale活化；2號～5號牛用于接種1號牛A.marginale感染時(shí)采集的血液，每頭接種150 mL，接種前一周每天肌注地塞米松磷酸鈉注射液，注射劑量為20 mg/頭，實(shí)驗(yàn)后注射劑量減半。

1.5 血液樣品的采集與處理 接種前后間隔4 d，每日飼喂前定點(diǎn)頸靜脈分別采抗凝血(肝素30 u/mL)和非抗凝血，抗凝血用于測定血液流變學(xué)指標(biāo)；非抗凝血分離血清，用于測定主要的生化指標(biāo)。

1.6 項(xiàng)目檢測 顯微鏡觀察并計(jì)算100個(gè)視野下受感染的紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的百分比。用終點(diǎn)法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(T-CHO)、肌苷(Cr)、尿素(BUN)、血糖(GLU)、血鐵(Fe)；用比色法測定α-羥丁酸脫氫酶(α-HBD)。測定方法按試劑盒說明操作。血液流變學(xué)指標(biāo)，包括全血比黏度(ηb)、血漿比黏度(ηp)、紅細(xì)胞壓積(PCV)、全血還原比黏度(ηr)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(AI)和紅細(xì)胞剛性指數(shù)(IR)按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行測定。

2 結(jié)果和討論

2.1 A.marginale感染紅細(xì)胞的動態(tài)變化 犢牛感染后第8 d～12 d在紅細(xì)胞中檢測到A.marginale，感染后第16 d～20 d，感染率達(dá)到峰值，隨后的數(shù)天紅細(xì)胞感染率保持在一個(gè)較高的水平；感染后第28 d，紅細(xì)胞感染率開始下降，逐漸降低到一個(gè)較低的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A.marginale感染的免疫抑制犢牛，體內(nèi)紅細(xì)胞感染率呈現(xiàn)一定的消長規(guī)律，與李海輝等的報(bào)道相似[7]。

2.2 感染期間生化指標(biāo)的變化 A.marginale感染的紅細(xì)胞，表面出現(xiàn)皺縮、突起，變形的紅細(xì)胞被機(jī)體視作免疫異物而清除，導(dǎo)致貧血。而肝臟、心肌、脾臟和腎臟等組織器官的病變，則影響血液中酶類、血鐵、膽固醇和葡萄糖等生化指標(biāo)的變化[8]。A.marginale感染后，T-CHO的含量呈下降趨勢，并且差異極顯著(p<0.01)；GPT的含量呈先上升后下降的趨勢，感染后8 d～12 d呈極顯著差異(p<0.01)，而且在感染后12 d達(dá)到峰值；GOT的含量呈先上升后下降的趨勢，感染后12 d達(dá)到峰值，并且差異顯著(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明動物感染A.marginale后，引起肝臟的損傷，導(dǎo)致GPT和GOT含量升高，T-CHO含量降低。其中，以在感染后12 d左右時(shí)對肝臟的損傷最為嚴(yán)重，隨后逐漸恢復(fù)。GLU的含量呈先下降后上升的趨勢，感染后16 d～24 d呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。血液中GLU的含量是機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)與腎臟機(jī)能的指標(biāo)，當(dāng)A.marginale感染機(jī)體后，引起食欲不振，使機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)下降，同時(shí)也會影響腎臟的功能，但其機(jī)理尚不清楚。ALP、Fe、BUN、LDH-L、α-HBDH和Cr的含量均呈先上升后下降的趨勢，但無顯著性差異(p<0.05)。其中，血Fe含量呈先上升后逐漸降低的變化，原因是當(dāng)牛感染后，紅細(xì)胞發(fā)生破碎，血紅蛋白中的Fe被釋放出來，導(dǎo)致血清Fe含量的升高，后期隨著病原的消除、機(jī)體的恢復(fù)而逐漸降低。LDH-L催化丙酮酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應(yīng)，是糖酵解和糖異生的主要酶之一，當(dāng)肝實(shí)質(zhì)性損害、腎臟疾病、心肌損傷時(shí)，該酶活性均升高。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)損傷嚴(yán)重時(shí)，血清Cr含量呈不同程度增高，因此將血清Cr含量作為腎病晚期的診斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Cr的含量呈先下降后上升的趨勢，表明在感染的后期，引起了腎實(shí)質(zhì)的損傷。α-HBDH呈逐漸上升趨勢，這是由于A.marginale感染后，引起血液中紅細(xì)胞破碎，發(fā)生溶血(圖1)。

2.3 感染期間血液流變學(xué)的變化 本實(shí)驗(yàn)中，全血還原高切比粘度和IR呈下降趨勢，并且差異極顯著(p<0.01)。ηb30 s-1和全血還原低切比粘度呈下降趨勢，并在感染10 d后具有顯著性差異(p<0.05)。ηb1 s-1呈下降趨勢，并且差異顯著(p<0.05)。ηb200 s-1、ηp、PCV和AI均呈下降趨勢，但差異不顯著(p>0.05)。ηb200 s-1和ηb1 s-1呈下降趨勢，表明感染A.marginale后，血液的粘滯性變?nèi)?、流動性變?qiáng)；PCV呈下降趨勢是由于感染引起紅細(xì)胞破碎的同時(shí)，紅細(xì)胞還在不斷的再生，所以紅細(xì)胞數(shù)量得到了補(bǔ)充；AI呈下降趨勢，表明在感染后，紅細(xì)胞的聚集性變?nèi)?圖2)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與馬海利等關(guān)于附紅細(xì)胞體引起血液流變學(xué)變化的結(jié)果不盡相同[9]，這可能與兩者致病機(jī)理之間的差異性有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)首次通過人工感染方法建立疾病動物模型，旨在揭示A.marginale對機(jī)體血液學(xué)方面的變化規(guī)律，為該病發(fā)病機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)資料。

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