徐明明，蔡雪輝，劉永剛，王淑杰，王洪峰，石文達(dá)，李麗琴，榮福龍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，可以引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)。該病于1996年在我國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)[1]，臨床表現(xiàn)為母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群呼吸道等癥狀。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約15 kb，包括9個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)。根據(jù)血清型和遺傳特性的差異，可將PRRSV劃分為2個(gè)基因型，即歐洲型和美洲型，目前國(guó)內(nèi)流行的主要基因型為美洲型。自2006年以來(lái)，高熱病的爆發(fā)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)研究證實(shí)引起該病的主要病原為高致病性PRRSV變異株(HP-PRRSV)[2]。

PRRSV GP3是由ORF3基因編碼的一種高度糖基化蛋白，在病毒的致病性、復(fù)制、裝配、變異和保護(hù)性反應(yīng)等方面可能具有重要意義。GP3在病毒粒子中含量較少，其功能尚不清楚[3]。應(yīng)用單克隆抗體(MAb)技術(shù)發(fā)現(xiàn)GP3中包含中和表位，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化、磷酸化、?；托盘?hào)肽切除等修飾，使表達(dá)蛋白質(zhì)正確折疊。因此，表達(dá)的外源蛋白在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性等方面更接近于天然蛋白[5]。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPPRRSV HuN4株的GP3，為進(jìn)一步研究GP3的結(jié)構(gòu)、功能以及免疫學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞及血清 HP-PRRSV HuN4株、大腸桿菌JM109、昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9均由本實(shí)驗(yàn)室保存；Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(包括質(zhì)粒pFastBacHTb，DH10Bac感受態(tài))購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HP-PRRSV(HuN4株)豬陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4 DNA連接酶、pMD18-T試劑盒、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker和膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；HRP、FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；轉(zhuǎn)染試劑盒Cellfectin Raegent、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Grace's和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 利用生物學(xué)軟件對(duì)HuN4株的ORF3基因的氨基酸序列進(jìn)行抗原性、親水性和疏水性分析，去除其位于N端的一部分疏水性區(qū)域(1 aa～49 aa)，設(shè)計(jì)引物。上下游引物兩端分別設(shè)計(jì)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn))。引物序列為：上游引物：5'-GCTGGATCCAGGGGCAATTTTT CTTTT-3'；下游引物：5'-ATACGAATTCCTATTTTG CGAATCGTCGGA-3'。通用引物 M13參照 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說(shuō)明設(shè)計(jì)。

1.4 基因的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 提取HP-PRRSV HuN4株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增ORF3基因，程序?yàn)椋?5℃5 min；94℃1 min、50℃45 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，提取質(zhì)粒，用PCR和酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pMDORF3。將pMD-ORF3和 pFastBacHTb經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ同時(shí)雙酶切后，用T4 DNA連接酶22℃連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，提取質(zhì)粒，用PCR和酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pF-ORF3，由北京百泰克公司測(cè)序。

1.5 重組桿粒的獲得與鑒定 將pF-ORF3轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH10Bac中，提取重組桿粒，以通用引物M13進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)擴(kuò)增片段的大小驗(yàn)證轉(zhuǎn)座是否成功，未發(fā)生重組的桿粒用M13引物擴(kuò)增可以得到約300 bp的片段，發(fā)生重組的桿粒，可得到包含轉(zhuǎn)座子內(nèi)側(cè)約3 000 bp的片段。重組桿粒命名為rBac-ORF3。

1.6 重組蛋白的表達(dá)及免疫學(xué)鑒定

1.6.1 重組蛋白的表達(dá) 按照Cellfectin Raegent轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將rBac-ORF3轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，72 h后收毒。同時(shí)轉(zhuǎn)染空的桿粒DNA，獲得野生型病毒AcMNPV。提取病毒DNA，以M13引物采用1.4反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定。重組病毒命名為 rAc-ORF3。將 rAc-ORF3按 1∶10比例接種 Sf9細(xì)胞，分別在接種后的24 h、48 h、72 h和96 h收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。同時(shí)設(shè)立野生型病毒感染Sf9細(xì)胞和健康Sf9細(xì)胞對(duì)照。

1.6.2 Western blot鑒定 rAc-ORF3按 1∶10比例接種Sf9細(xì)胞，接種后72 h收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳 4℃封閉過(guò)夜，加入 1∶50倍稀釋的 HPPRRSV(HuN4株)豬陽(yáng)性血清，37℃孵育1 h，加入1∶20 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的抗豬IgG，37℃孵育1 h，DAB顯色5 min。同時(shí)設(shè)野生型病毒感染的Sf9細(xì)胞和健康Sf9細(xì)胞對(duì)照。

1.6.3 間接免疫熒光(IFA)鑒定 將rAc-ORF3按1∶10比例感染24孔板培養(yǎng)的單層Sf9細(xì)胞，直至細(xì)胞出現(xiàn)病變，棄上清，細(xì)胞用3%多聚甲醛固定15 min，加入1∶100倍稀釋的HuN4株豬陽(yáng)性血清，37℃孵育1 h，加入1∶100倍稀釋的FITC標(biāo)記的抗豬IgG，37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

1.7 重組蛋白的純化 大量收集接種重組病毒72 h后的Sf9細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。用0.25 mol/L KCl染色凝膠30 s～60 s，切下目的蛋白，用電洗脫儀洗脫5 h，收集蛋白并測(cè)定濃度。

1.8 小鼠GP3抗血清的制備及測(cè)定 將20 μg純化并鑒定后的GP3抗原加入等體積的福氏完全佐劑，乳化后皮下多點(diǎn)注射免疫6周齡BALB/c雌性小鼠6只。初免后，每隔3周用同樣抗原加入等體積福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫2次。以本實(shí)驗(yàn)室制備并純化的原核表達(dá)GP3作為包被抗原，采用間接ELISA，測(cè)定OD450nm值，檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 基因的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 應(yīng)用特異性引物從HP-PRRSV HuN4株cDNA擴(kuò)增出ORF3基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約600 bp處可見(jiàn)特異性片段，與預(yù)期相符(618 bp)(圖1)。陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到與目的片段大小一致的片段，測(cè)序結(jié)果表明ORF3基因正確插入到pFastBacHTb載體中。

2.2 重組桿粒的PCR鑒定 用M13引物對(duì)重組桿粒進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出約3 000 bp的片段，與預(yù)期片段相符(3 070 bp)；以桿粒為模板的對(duì)照擴(kuò)增出約300 bp的片段。

2.3 重組桿狀病毒PCR鑒定 提取重組病毒DNA，用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出約3 000 bp的片段，與預(yù)期相符(3 070 bp)；以野生型病毒AcMNPV為模板的對(duì)照擴(kuò)增出約300 bp的條帶(圖2)，表明ORF3基因成功重組到桿狀病毒基因組中。

2.4 重組蛋白的表達(dá)、純化以及western blot鑒定重組病毒接種Sf9細(xì)胞，72 h后接種細(xì)胞變圓變大，細(xì)胞核變大，邊緣透光率增加，細(xì)胞開(kāi)始脫落。分別收集接毒后24 h、48 h、72 h、96 h的細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明，在分子量約26 ku處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期相符(27 ku)，野生型病毒接種的Sf9細(xì)胞和健康Sf9細(xì)胞對(duì)照無(wú)此條帶(圖3)。表明重組蛋白在細(xì)胞接毒72 h后獲得表達(dá)，72 h與96 h的表達(dá)量無(wú)明顯區(qū)別。切膠回收目的蛋白，含量為2 mg/mL～4 mg/mL。Western blot試驗(yàn)表明表達(dá)的GP3具有良好的反應(yīng)原性(圖4)。

2.5 重組桿狀病毒IFA鑒定 將rAc-ORF3按1∶10比例感染24孔板培養(yǎng)的單層Sf9細(xì)胞，進(jìn)行IFA鑒定。熒光顯微鏡下結(jié)果顯示，感染rAc-ORF3的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而感染野生病毒的Sf9細(xì)胞和健康 Sf9細(xì)胞均無(wú)可見(jiàn)熒光(圖5)，進(jìn)一步證明HP-PRRSV HuN4株GP3蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到了正確表達(dá)，具有較好的反應(yīng)原性。

2.6 小鼠抗血清檢測(cè)結(jié)果 以免疫前小鼠的血清及用PBS小鼠的血清作為陰性對(duì)照，采用間接ELISA測(cè)定血清的免疫活性。方陣滴定確定經(jīng)原核表達(dá)并純化的GP3包被濃度為3 μg/mL，小鼠血清稀釋倍數(shù)為400倍。以P/N≥2.1的血清最高稀釋度為抗體效價(jià)。結(jié)果顯示桿狀病毒表達(dá)的重組GP3二免后7 d檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1∶6 400以上，三免后7 d抗體效價(jià)達(dá)到1∶12 800以上，并且至少可以持續(xù)1個(gè)月。說(shuō)明表達(dá)的重組GP3具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3 討 論

目前，對(duì)PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M、N的研究比較多，而對(duì)次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3的結(jié)構(gòu)和功能等方面研究較少。在對(duì)歐洲株LV株的研究中證明GP3參與病毒粒子囊膜的組裝，是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[6]，而對(duì)于加拿大Quebec IAF-Klop株研究表明GP3不是病毒粒子的組成成分，而是弱的膜相關(guān)蛋白[7-8]。最新研究表明，美洲株FL12株的GP3同歐洲株一樣，屬于病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[9]。由于GP3的結(jié)構(gòu)與功能尚存在爭(zhēng)議，因此，有必要對(duì)該蛋白進(jìn)行深入研究。GP3是PRRSV各毒株之間變異性較高的蛋白之一，HP-PRRSV與經(jīng)典株之間GP3的氨基酸共有8個(gè)位點(diǎn)突變，其中4位點(diǎn)個(gè)屬于非保守性突變，3個(gè)位點(diǎn)位于預(yù)測(cè)的抗原表位，1個(gè)位點(diǎn)位于C末端，第83位保守性突變可能與PRRSV毒力相關(guān)[10]。因此，本研究選取HP-PRRSV的代表株HuN4株，通過(guò)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其GP3進(jìn)行表達(dá)。

在本研究中我們根據(jù)對(duì)HP-PRRSV HuN4株GP3的氨基酸序列進(jìn)行抗原性、親水性和疏水性的分析，去除了其位于N端的一部分疏水性區(qū)域(1 aa～49 aa)，然后對(duì)其進(jìn)行融合表達(dá)。從表達(dá)產(chǎn)物的western blot及IFA反應(yīng)結(jié)果證實(shí)，該重組蛋白具有良好的反應(yīng)活性。這與蔣文明等、劉金霞等的研究結(jié)果一致[11-12]。

GP3屬于糖基化的蛋白，具有7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，因此用凝膠電泳觀(guān)察到的GP3的分子量(42 ku～50 ku)大于預(yù)測(cè)的GP3分子量(27 ku～29 ku)[3,7]。本研究中表達(dá)的GP3分子量約為27 ku，表明表達(dá)的GP3沒(méi)有糖基化修飾?？赡苁且?yàn)槿コ宋挥贕P3 N端的一部分疏水性區(qū)域后，使N-糖基化位點(diǎn)不完整，造成GP3不能進(jìn)行糖基化修飾。

本研究最初嘗試采用Ni-NTA樹(shù)脂純化GP3，但純化的效果較差，不僅雜蛋白多而且濃度較低。因此，采用切膠純化的方法，獲得了理想效果。將其免疫小鼠，制備的多克隆血清與原核表達(dá)并純化的GP3蛋白反應(yīng)良好，進(jìn)一步證明用該方法純化蛋白的可行性。

有研究發(fā)現(xiàn)GP3可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其中和抗體能夠中和病毒，而且針對(duì)GP3的抗體無(wú)抗體依賴(lài)性增強(qiáng)作用[4]。Plana等用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)GP3，該蛋白免疫后能夠保護(hù)豬抗PRRSV感染，保護(hù)率達(dá)到68.4%[13]。因此，深入研究GP3的免疫特性及其相應(yīng)功能具有一定的理論意義和實(shí)踐意義?？傊狙芯坷脳U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HP-PRRSV HuN4株GP3，并證明GP3具有良好的免疫原性，為進(jìn)一步研究GP3的結(jié)構(gòu)和功能以及研制PRRSV基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

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