梁珍珍，解玉東，張艷莉，韓麗麗，呂燕平

(周口市中心醫(yī)院呼吸科， 河南 周口 466000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruction pulmonary disease，COPD)是一種全球性疾病，目前居全球死因第4位，且預(yù)計(jì)至2030年COPD將居全球疾病死因第3位[1]。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，40歲以上人群COPD的發(fā)病率為8.2%[2]，其發(fā)病率和死亡率有日益增高的趨勢(shì)[1]。在COPD疾病進(jìn)程中，長(zhǎng)期的慢性炎癥導(dǎo)致的黏膜下腺增生、黏蛋白過(guò)度分泌、纖維化、氣道平滑肌的增生肥大及氣道微血管的再生等病理性變化，即氣道重塑，是COPD患者肺功能減退的關(guān)鍵性病理變化[3]，其中氣道炎癥貫穿氣道重塑的整個(gè)過(guò)程，氣道纖維化是氣道重塑的重要病理變化形式，因此抑制支氣管上皮細(xì)胞致炎因子的分泌與纖維化進(jìn)展相關(guān)蛋白的表達(dá)有望抑制氣道重塑并減輕COPD進(jìn)展。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)可參與多種肺部疾病的發(fā)病過(guò)程，如肺結(jié)核[4]、肺癌[5]、COPD[6]、哮喘[7]和特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)[8]等。近年來(lái)在一項(xiàng)連續(xù)動(dòng)態(tài)模擬COPD大鼠的模型中發(fā)現(xiàn)，COPD組的miR-181a表達(dá)下調(diào)，且隨著COPD的進(jìn)展逐步下調(diào)[9]。然而miR-181a與氣道重塑的關(guān)系尚未明了?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯窟x取香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，HBECs)，觀察miR-181a的表達(dá)、致炎因子生成、IV型膠原蛋白(collagen IV)、纖連蛋白(fibronectin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)的關(guān)系，并進(jìn)一步分析其相關(guān)機(jī)制，為并評(píng)估m(xù)iR-181a是否可以作為防治COPD的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

胎牛血清購(gòu)自PAA；EGM-2-MV內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Lonza；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；抗磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor-κB，p-NF-κB) p65、NF-κB p65、collagen IV、fibronectin和α-SMA抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗p-Smad3、Smad3和TGF-β1抗體購(gòu)自CST；抗GAPDH抗體購(gòu)自江蘇碧云天生物公司；miR-181a引物、miR-181a模擬物(miR-181a mimic)和miR mimic陰性對(duì)照(miR mimic negative control,NC-m)由上海吉瑪公司合成。

2 香煙提取物的制備

參照文獻(xiàn)方法[10]，取市售芙蓉王牌香煙，去除過(guò)濾嘴后，連接吸煙機(jī)，設(shè)置抽煙速度為每支5 min。取10支完全燃燒后產(chǎn)生的煙霧完全溶于10 mL無(wú)血清的EGM-2-MV內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾后，此培養(yǎng)基定義為100% CSE母液。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的CSE濃度為此培養(yǎng)基所占終體積的百分比。

3 方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞模型的建立 HBECs購(gòu)于Sciencell。HBECs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的EGM2-MV內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，每3 d換液 1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBECs接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化12 h，后更換正常培養(yǎng)基，用含不同濃度(5%、10%和20%)的CSE處理細(xì)胞48 h，或20% CSE處理細(xì)胞24、48和72 h，RT-qPCR檢測(cè)miR-181a的表達(dá)，確定CSE的最佳作用濃度。

3.2miR-181a mimic轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)前 1 d常規(guī)消化對(duì)數(shù)期HBECs，按照2×109/L的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化12 h。按照說(shuō)明書(shū)方法，進(jìn)行 miR-181a mimic和NC-m轉(zhuǎn)染，將miR-181a mimic和NC-m分別與Lipofectamine 3000溶于無(wú)血清培養(yǎng)基中，室溫孵育30 min；分別將混合物加至相應(yīng)組別的細(xì)胞中，無(wú)血清培養(yǎng)基孵育6 h，更換為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

3.3細(xì)胞分組 將HBECs分為正常對(duì)照組(control組，細(xì)胞正常培養(yǎng))、miR-181a mimic組、NC-m組、CSE處理組(20% CSE處理細(xì)胞)、CSE+miR-181a mimic組(20% CSE處理miR-181a mimic轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)和CSE+NC-m組(20%CSE處理NC-m轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)，以上各組HBECs繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子的含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBECs接種于96孔板，細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，48 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液。IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量的檢測(cè)均按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品按每孔50 μL加入包被相應(yīng)抗體的酶標(biāo)板中，室溫孵育2 h，甩去酶標(biāo)板中的液體，每孔加入100 μL對(duì)應(yīng)的生物素化標(biāo)記的抗體工作液，室溫孵育1 h，PBS洗3次，每孔加入100 μL親和素-過(guò)氧化物復(fù)合物工作液，室溫孵育45 min，PBS洗3次，每孔加入100 μL顯色液，室溫孵育10 min，最后每孔加入100 μL終止液，液體由藍(lán)色變?yōu)辄S色即可在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的含量。

3.5RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)SuperScript III Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green RT-qPCR試劑盒的操作步驟，通過(guò)ABI 7300 PCR儀檢測(cè)miR-181a的表達(dá)。miR-181a的上游引物序列為5’-TCACTCCTCTCCTCCCG-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6的上游引物序列為5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。 qPCR反應(yīng)體系包括 1 μL cDNA樣品、10 μL SYBR Green PCR Master Mix和0.4 μL上、下游引物。反應(yīng)條件為95 ℃孵育5 min；然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、74 ℃ 25 s)。以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法分析miR-181a的表達(dá)。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE。待電泳結(jié)束后，采用濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉后，按抗體說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)稀釋比例的 I 抗(抗collagen IV、fibronectin、α-SMA、p-Smad3、Smad3、TGF-β1、p-NF-κB p65和NF-κB p65抗體)，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)稀釋比例的 II 抗室溫孵育45 min，ECL化學(xué)曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，IPP6.0軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用方差分析，4組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析的post-hoc test Bonferroni-t檢驗(yàn)，6組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析的post-hoc test SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CSE對(duì)HBECs miR-181a表達(dá)的影響

給予5%、10%和20%的CSE分別處理細(xì)胞48 h后，miR-181a表達(dá)的變化顯示，CSE濃度依賴性抑制HBECs的miR-181a表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖1A；給予20%的CSE分別處理細(xì)胞24、48和72 h后，miR-181a的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且48 h和72 h 2個(gè)時(shí)點(diǎn)的miR-181a表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1B。綜合考慮結(jié)果，采用20%的CSE處理48 h為本研究的最佳作用條件。

Figure 1.The effect of CSE on the expression of miR-181a in the HBECs was determined by RT-qPCR. A: HBECs were treated with CSE at different concentrations for 48 h; B: HBECs were treated with 20% CSE for different times. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1CSE對(duì)HBECsmiR-181a表達(dá)的影響

2 miR-181a過(guò)表達(dá)對(duì)CSE誘導(dǎo)的HBECs釋放致炎因子的影響

ELISA結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CSE處理組致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平均升高(P<0.05)；與CSE處理組比較，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic能部分逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成(P<0.05)，見(jiàn)圖2。說(shuō)明 miR-181a過(guò)表達(dá)可部分抑制CSE誘導(dǎo)的HBECs致炎因子生成。

3 miR-181a過(guò)表達(dá)對(duì)CSE誘導(dǎo)的HBECs中collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CSE處理組collagen IV、fibronectin和α-SMA的表達(dá)均升高(P<0.05)；與CSE處理組比較，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic能抑制CSE誘導(dǎo)的collagen IV、fibronectin和α-SMA的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。說(shuō)明 miR-181a過(guò)表達(dá)可抑制CSE誘導(dǎo)的HBECs中collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)。

Figure 2.The effect of miR-181a mimic on CSE-evoked pro-inflammatory factor levels in HBECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖2miR-181amimic對(duì)CSE誘導(dǎo)的HBECs釋放致炎因子的影響

Figure 3.The effect of miR-181a mimic on CSE-evoked the expressions of collagen IV, fibronectin and α-SMA in HBECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖3miR-181amimic對(duì)CSE誘導(dǎo)的collagenIV、fibronectin和α-SMA表達(dá)的影響

4 miR-181a過(guò)表達(dá)對(duì)CSE誘導(dǎo)的HBECs中NF-κB/TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CSE處理組的p-NF-κB p65、TGF-β1和p-Smad3蛋白水平均升高(P<0.05)；與CSE處理組比較，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic能下調(diào)CSE誘導(dǎo)的p-NF-κB p65、TGF-β1和p-Smad3的蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)圖4。結(jié)果提示miR-181a過(guò)表達(dá)可能通過(guò)減弱NF-κB/TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活性，抑制CSE誘導(dǎo)的HBECs致炎因子生成與collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)。

Figure 4.The effect of miR-181a mimic on CSE-evoked the activation of NF-κB/TGF-β1/Smad3 pathway in HBECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖4miR-181amimic對(duì)CSE誘導(dǎo)的NF-κB/TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活性的影響

討 論

COPD是以煙霧和病毒等長(zhǎng)期誘導(dǎo)的以慢性炎癥性為主要臨床特征的氣道疾病，氣道重塑為COPD肺功能減退的關(guān)鍵性病理變化[3]。本研究以CSE刺激HBECs的基礎(chǔ)上探究miR-181a在氣道重塑中的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSE可顯著增加HBECs的致炎因子生成與collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)，同時(shí)使miR-181a表達(dá)水平降低，該研究結(jié)果提示miR-181a可能參與COPD進(jìn)程中氣道重塑的病理生理過(guò)程。

miR-181a是一個(gè)典型的多功能miRNA，其主要參與細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等的多種生物學(xué)功能[9, 11-12]， 如Sonkoly等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-181a能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和炎癥反應(yīng)；在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)急性肺損傷研究中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-181a能顯著抑制致炎因子分泌，保護(hù)LPS引起的肺損傷[12]；在COPD中，香煙刺激的小鼠COPD模型和COPD患者肺組織中，miR-181表達(dá)下調(diào)[9]。但其在COPD的氣道重塑中作用還有待進(jìn)一步的研究確證，本研究通過(guò)在HBECs中轉(zhuǎn)染miR-181a mimic使得miR-181a過(guò)表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從致炎因子生成與collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)的角度探討了miR-181a的作用，結(jié)果顯示miR-181 過(guò)表達(dá)可明顯抑制CSE誘導(dǎo)HBECs中致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1的生成及collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)，提示miR-181可影響COPD進(jìn)程中氣道重塑的病理變化。

NF-κB具有廣泛的生物學(xué)活性，眾多研究提示NF-κB信號(hào)通路是肺部炎癥性疾病中多種免疫炎癥相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，參與COPD的發(fā)生發(fā)展[13-14]。而TGF-β1/Smads 信號(hào)通路與COPD氣道炎癥和氣道重塑關(guān)系密切[15-16]。早期暴露于煙霧等有害氣體刺激肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致NF-κB激活，而激活的NF-κB暴露TGF-β1結(jié)合位點(diǎn)，直接促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，活化TGF-β1/Smads途徑[17]。TGF-β1作為COPD發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵致病因子，與氣道重塑密切相關(guān)，Smad2/3在COPD氣道重塑中發(fā)揮促進(jìn)作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)CSE能誘導(dǎo)HBECs中致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的釋放，在CSE刺激下HBECs細(xì)胞中p-NF-κB p65、TGF-β1和p-Smad3的蛋白水平增加，TGF-β1生成增加，提示有NF-κB/TGF-β1/Smad3的活化；而轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后HBECs細(xì)胞中NF-κB/TGF-β1/Smad3的活性被抑制。結(jié)果提示miR-181a過(guò)表達(dá)可能通過(guò)減弱NF-κB/TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的活性，抑制CSE誘導(dǎo)的HBECs炎性反應(yīng)與collagen IV、fibronectin、α-SMA的表達(dá)。但miR-181a調(diào)控NF-κB/TGF-β1/Smad3的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，CSE可誘導(dǎo)HBECs中致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成及collagen IV、fibronectin和α-SMA表達(dá)，而miR-181a過(guò)表達(dá)可部分緩解這種病理改變，從而在COPD的氣道重塑的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定的拮抗作用；此外，miR-181a過(guò)表達(dá)可部分抑制CSE誘導(dǎo)的HBECs中致炎因子生成和collagen IV、fibronectin、α-SMA表達(dá)，可能與其抑制NF-κB/TGF-β1/Smad3通路的活性相關(guān)。以上結(jié)果提示miR-181a可以作為防治COPD的新靶點(diǎn)。