穆立煥，王穎，佟俊旺，金秀平，陳茜，徐謙，楊麗婉，江蘭

（1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063210；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 唐山063000；3.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210）

國際糖尿病聯(lián)盟2017年數(shù)據(jù)表明，全球4.25億成年人患糖尿病，2.12億未被確診，預(yù)計2045年將達(dá)6.29億[1]。糖尿病腎病是多基因參與的遺傳性疾病[2-3]。高血壓、高血脂、高血糖參與糖尿病腎病的發(fā)病。近年來多項研究表明，G-2548A多態(tài)性與大血管病變有關(guān)，但對微血管病變研究甚少，糖尿病腎病屬于微血管病變，或許與大血管病變有相同的發(fā)病機制。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對G-2548A多態(tài)性進行研究，旨在探討該位點多態(tài)性與糖尿病腎病的關(guān)系，為疾病的早期診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2017年5月在華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌病區(qū)住院的2型糖尿病腎病和無糖尿病腎病的2型糖尿病患者416例，均無血緣關(guān)系。患者常規(guī)降血糖、降血脂、降血壓治療不變。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病酮癥等急性并發(fā)癥、泌尿系感染、其他腎臟相關(guān)疾病、心功能不全、惡性腫瘤、妊娠、哺乳期及資料不完整等。通過測定尿微量白蛋白將患者分為兩組：無糖尿病腎病組男性102例，女性122例，平均年齡（56.2±11.1）歲；2型糖尿病腎病組男性96例，女性96例，平均年齡（58.3±11.5）歲。兩組患者年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2016113），所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標(biāo) 測量身高、體重并計算體重指數(shù)（BMI），測量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）。采用乳膠凝集反應(yīng)法測定糖化血紅蛋白（HbA1C）（寧波瑞源生物科技有限公司）。應(yīng)用Olympus AU5400全自動生化分析儀（日本Olympus公司）測定相關(guān)血清指標(biāo)：尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白A、載脂蛋白B。應(yīng)用酶聯(lián)免疫法瘦素試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）測定血清瘦素。

1.2.2 分析瘦素基因多態(tài)性 抽取空腹靜脈血3 ml，應(yīng)用北京莊盟國際生物基因科技有限公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，PCR擴增DNA。查找Genebank中瘦素基因組序列，根據(jù)文獻[4]并使用引物設(shè)計軟件Premier 5.0優(yōu)化設(shè)計rs7799039位點所在序列引物?；驍U增引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。正向引物：5'GGATGGAGGCCCTAGTGGAA3'，反向引物：5'GAGATTAAAGCAAAGACAGGCA3'。瘦素基因擴增體系：PCR Taq Master Mix 12.5μl，正反向引物各1.0μl，DNA模板1.0μl，雙蒸水25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。取PCR產(chǎn)物加樣于瓊脂糖凝膠孔中進行電泳，在紫外透視儀（安慶昌嘉電子產(chǎn)品貿(mào)易有限公司）下觀察結(jié)果并拍照。最后進行酶切（內(nèi)切酶HhaI由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司提供），在紫外透視儀下根據(jù)條帶位置和數(shù)目確定基因型，使用凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，比較用秩和檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較

2型糖尿病腎病組與無糖尿病腎病組患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），2型糖尿病腎病組患者瘦素、HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓高于無糖尿病腎病組。兩組患者UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者血壓比較 （mmHg，x±s）

2.2 遺傳平衡檢驗結(jié)果

將所有研究對象進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，AA、AG、GG基因型頻率分別為68.0%、30.3%和1.7%，A等位基因頻率為83.2%，G等位基因頻率為16.8%，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.802，P=0.094），該位點基因型和等位基因頻率已達(dá)Hardy-Weinberg平衡，來自同一群體，具有群體代表性。

2.3 瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性比較

酶切產(chǎn)物電泳后可分為3種基因型，AA、AG和GG（見附圖）。兩組基因型分布頻率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組等位基因分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

附圖 瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性電泳圖

表3 兩組瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因型和等位基因的分布頻率比較 例（%）

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要病因之一[5]。至今，糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不清楚，可能是多因素相互作用的結(jié)果[6]。其早期表現(xiàn)為腎小球高灌注、高濾過，然后出現(xiàn)蛋白尿，晚期表現(xiàn)為腎衰竭。JARDINE等[7]研究表明，糖代謝紊亂、高血壓、高血脂、糖尿病病程、性別、年齡等與糖尿病腎病的進展相關(guān)。本研究結(jié)果表明，2型糖尿病腎病組收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、BUN、SCr高于無糖尿病腎病組，而兩組UA、TG、TC、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B無差別，與JARDINE等[7]的研究結(jié)果不完全相同。有研究表明，HbA1C、BUN、SCr、收縮壓、舒張壓與對照組相比顯著升高[8-10]，與本研究結(jié)果一致。李澤宇等[10]研究指出，糖尿病組血脂水平與糖尿病腎病組有差別，與本研究結(jié)論不同，考慮可能與糖尿病腎病組患者服用降脂藥物有關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn)，由脂肪組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，瘦素就是其中之一。MOON等[11]研究發(fā)現(xiàn)，瘦素與糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)。段永強等[12]研究表明，病例組與對照組的瘦素水平有差別，與本研究結(jié)論一致。瘦素是瘦素基因編碼的產(chǎn)物，主要由白色脂肪產(chǎn)生，是脂肪細(xì)胞分泌的肽類激素，由167個氨基酸組成，在調(diào)節(jié)機體能量平衡、體重及許多生理代謝方面起重要作用。MüNZHERG等[13]研究指出，瘦素促進細(xì)胞修復(fù)及血管形成。瘦素分泌受多種因素影響，其中基因調(diào)控區(qū)變異也是影響因素之一。瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A是較常見的單核苷酸多態(tài)性。有研究者稱該單核苷酸多態(tài)性或許從轉(zhuǎn)錄水平影響瘦素基因的表達(dá)及循環(huán)瘦素的高低[14]。王立坤等[15]研究表明，瘦素在糖尿病微血管病變形成過程中起重要作用。瘦素和瘦素受體基因多個位點存在多態(tài)性，許多研究證實，該基因多態(tài)性參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[14-15]。目前國內(nèi)外對瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因多態(tài)性相關(guān)疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞喎Q冠心?。⒏哐獕旱榷加醒芯?，但對2型糖尿病腎病研究甚少。譚藝青等[16]研究表明，瘦素rs4731426、rs2167270基因多態(tài)性與我國南方漢族人群冠心病無關(guān)聯(lián)。翟公偉[17]研究表明，瘦素基因啟動子-2548G/A存在不同的基因型，早發(fā)冠心病組與正常對照組基因型分布不同，該位點多態(tài)性與冠心病發(fā)病有關(guān)，其中A等位基因可能是其發(fā)病的遺傳易感基因。本研究以瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因變異作為標(biāo)記，探討該基因的變異和2型糖尿病腎病易感性的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)無糖尿病腎病患者與2型糖尿病腎病患者瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A基因多態(tài)性分布有差異，其中2型糖尿病腎病患者AA、AG基因型頻率和A等位基因的分布頻率較無糖尿病腎病組升高。

綜上所述，瘦素基因啟動子區(qū)G-2548A多態(tài)性與2型糖尿病腎病患者有一定的相關(guān)性，A等位基因可能是其發(fā)病的易感基因。通過檢測基因型和等位基因頻率可以篩查2型糖尿病腎病。由于本研究樣本量小，尚需進行大樣本研究來證實，同時本研究為病例對照研究，驗證因果關(guān)聯(lián)能力弱，尚需前瞻性研究彌補不足。