李菲 張雪純 張鐿山 宋寶麗

【摘要】目的 通過對(duì)苯丙酮尿癥（Phenylketonuria，PKU）患者苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突變的分析，為苯丙酮尿癥的產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢、治療和采取干預(yù)措施提供一定的科學(xué)依據(jù)。方法 應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法對(duì)123例PKU患者PAH基因第1～13外顯子及其兩側(cè)內(nèi)含子進(jìn)行序列分析。結(jié)果 在123例患者的246個(gè)PAH等位基因中檢測出了216個(gè)PAH基因突變位點(diǎn)，總檢出率為87.8%（216/246），其中外顯子3、6、7、10、11和12檢出率相對(duì)較高。共發(fā)現(xiàn)59種突變，包括42種錯(cuò)義突變、8種剪接突變、5種無義突變、2種移碼突變、2種同義突變。高頻突變位點(diǎn)主要是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。結(jié)論 PKU患者具有明顯的突變熱點(diǎn)（R243Q、R111X、EX6-96A>G、R413P、V1399V）和突變熱點(diǎn)區(qū)域（外顯子3、6、7、10、11、12）。通過PAH基因直接測序可對(duì)大部分的PKU家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

【關(guān)鍵詞】苯丙酮尿癥;苯丙氨酸羥化酶;基因突變;產(chǎn)前診斷

【中圖分類號(hào)】R589 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2019.2..03

苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病[1]。主要由于苯丙氨酸羥化酶基因突變導(dǎo)致PAH活性降低或喪失，使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸，導(dǎo)致血液中苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）濃度增高并在神經(jīng)系統(tǒng)和血液中蓄積。PKU患者如未及時(shí)治療，將由于過量的Phe及其代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒性作用而導(dǎo)致嚴(yán)重的智力障礙、精神發(fā)育遲滯和繼發(fā)性癲癇等。PKU的發(fā)病率有種族和地區(qū)差異[2-6]，我國約為1/11144[7]，且PAH基因突變具有相對(duì)突變熱點(diǎn)及突變熱點(diǎn)區(qū)域，因此可以通過對(duì)PKU患者進(jìn)行基因診斷分析，了解各種突變的種類和分布，了解所研究的人群中PAH基因相對(duì)突變熱點(diǎn)和突變熱點(diǎn)區(qū)域，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)前診斷和治療提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

230例PKU患者，來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心遺傳咨詢門診，其中，男123例，女107例，年齡16天～37歲。230例患者來自230個(gè)無關(guān)家庭，所有患者的父母均非近親結(jié)婚。這230例患者治療前血苯丙氨酸濃度Phe>480 μmol/L，平均（915.52±513.66），通過Phe負(fù)荷試驗(yàn)和尿蝶呤分析結(jié)合臨床癥狀排除了四氫生物喋呤缺乏癥。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)

抽取患者的外周血并用EDTAK2抗凝，-20℃儲(chǔ)存。200名正常DNA來自實(shí)驗(yàn)室積累的健康無血緣關(guān)系個(gè)體。采用北京天根D315DNA分離試劑盒提取采集的抗凝外周血樣品中的DNA。參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)PAH基因第1～13外顯子的引物。常規(guī)PCR擴(kuò)增條件：95℃5 min熱變性，94℃變性30 s，55～62℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在美國ABI公司Verteri梯度PCR儀上完成。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖檢測。

1.2.2 DNA序列分析

采用PCR產(chǎn)物直接測序法對(duì)樣品中DNA進(jìn)行序列分析。PCR產(chǎn)物的純化和DNA序列分析由上海生物工程科技有限公司應(yīng)用美國ABI公司3730XL全自動(dòng)DNA序列分析儀完成。所有PCR產(chǎn)物均采用正反向測序。

2 結(jié) 果

2.1 PAH基因突變的檢出率

通過對(duì)123例PKU患者PAH基因外顯子和內(nèi)含子分析，在246條染色體中共檢測到216個(gè)突變（表1），總檢出率為87.8%。所有患者均檢測到突變基因，其中93個(gè)人檢測出2個(gè)突變位點(diǎn)，占75.6%。30個(gè)人檢測出一個(gè)突變位點(diǎn)。

2.2 PAH基因突變種類

檢測到的216個(gè)突變分屬59種突變，其中錯(cuò)義突變42種、剪接突變8種、無義突變5種、移碼突變2種、同義突變2種。

2.3 PAH基因突變分布特點(diǎn)

患者突變主要分布在第3，6，7，10，11，12外顯子，其中第7外顯子檢測到的突變最多，共12次。其次為第11外顯子，共9次。第12、10、3、6外顯子分別為7、6、5、5次。

2.4 PAH基因高頻突變位點(diǎn)

突變頻率最高的是p.R243Q，共檢測到50次，p.R111X檢測到18次，EX6-96A>G檢測到17次，p.R413P檢測到17次，p.V1399V檢測到14次。

3 討 論

PKU是少數(shù)幾種可治療的嚴(yán)重單基因遺傳病，而基因診斷是PKU唯一有效的產(chǎn)前診斷措施，可通過基因診斷對(duì)新生兒進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)PKU患者，及時(shí)治療，可減輕患兒的病情。但PKU患兒需進(jìn)行長期治療，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及精神壓力，通過基因診斷，避免生育PKU患兒是一種很好的對(duì)策。

1983年，PAH基因被成功分離、克隆[8]。PAH基因定位于染色體12q22-q24.1，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)全長90kb，編碼含有452個(gè)氨基酸殘基的酶單體，單體聚合成有功能的PAH，參與苯丙氨酸代謝。任何一種突變都有可能導(dǎo)致PAH結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶活性的改變，影響苯丙氨酸的代謝過程。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸羥化酶基因一千余種突變（http：/ www.Pahdb.mcgil1.ca），國內(nèi)報(bào)道的有100多種[9-11]。本文對(duì)123個(gè)先證者進(jìn)行基因診斷，一共檢測到59種突變，216個(gè)突變位點(diǎn)，總檢出率為87.8%。應(yīng)用MLPA技術(shù)，檢測出123個(gè)先證者中有4種大片段缺失，包括5'UTR_E1雜合缺失，E4_E5雜合缺失，E5雜合缺失，E4_E7雜合缺失。上述結(jié)果提示PKU患者基因突變類型多樣，位置多變，突變位置可發(fā)生在外顯子、內(nèi)含子及5'UTR、3'UTR。

現(xiàn)在世界各地PAH基因突變研究者都在致力尋找PAH基因的高頻突變位點(diǎn)，以便通過產(chǎn)前診斷篩查出PKU患者。本文結(jié)果顯示PAH基因突變有相對(duì)集中特點(diǎn)，高頻突變位點(diǎn)分別是p.R243Q（23.15%），p.R111X（8.33%），EX6-96A>G（7.87%），p.R413P（7.87%）、p.V1399V（6.48%）。突變熱點(diǎn)區(qū)域主要是外顯子3（8.5%），6（8.5%），7（20.3%），10（10.2%），11（15.3%），12（11.9%），其中第7外顯子檢測到的突變最多為12次。參考Lee[12]等報(bào)道中國人的高頻突變主要位于第7外顯子的R243Q（23.15%），本文結(jié)果與之比較一致。在123個(gè)先證者中，有93個(gè)人都檢測出兩個(gè)突變位點(diǎn)，提示在PKU患者中兩個(gè)突變位點(diǎn)的突變率較高，這可以作為鑒別診斷的輔助手段之一。與此同時(shí)，這些檢測出兩個(gè)突變位點(diǎn)的家系，如果其父母再次懷孕時(shí)，可以直接選擇基因診斷突變位點(diǎn)來確診胎兒是否是PKU患者，以免再次生出PKU患兒，為家庭帶來不必要的麻煩。

很多學(xué)者的研究已經(jīng)表明，在不同種族和地區(qū)PKU患者基因突變位點(diǎn)的分布具有明顯差異性，因此研究PKU的分布及類型，對(duì)于開展產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢有一定的意義。如當(dāng)對(duì)PKU患者群體進(jìn)行突變分析時(shí)，由本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可優(yōu)先選擇第3、6、7、10、11和12外顯子直接測序，即可篩查出約74.6%的突變，之后可以再對(duì)其他外顯子測序，這樣可以避免全編碼區(qū)測序產(chǎn)生的不必要的浪費(fèi)，并提高產(chǎn)前診斷的效率。

本研究明確了PAH基因突變的類型、分布和高頻突變位點(diǎn)，為PAH基因突變的研究增加了一定的資料，豐富了中國人群的PAH基因突變譜。但本研究數(shù)據(jù)比較少，下一步就是擴(kuò)大樣本數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對(duì)樣本中基因突變類型、分布與高頻突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。通過對(duì)PAH基因突變數(shù)據(jù)的分析，可以為產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢提供理論依據(jù)，對(duì)減低PKU的發(fā)病率，減輕患兒的病情，減少PKU患兒的出生以及提高人口整體素質(zhì)具有重要意義。

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本文編輯：劉欣悅