謝曉亮 李玉梅 朱海霞 樊天佑

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年長(zhǎng)骨干骺端的原發(fā)性間葉組織惡性腫瘤，由間充質(zhì)干細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化受阻引起。其特點(diǎn)為腫瘤可產(chǎn)生類(lèi)骨質(zhì)，具有局部入侵、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及易復(fù)發(fā)的傾向[1-2]。僅接受手術(shù)治療的骨肉瘤患者5年生存率低于20%[3]。隨著以氨甲蝶呤、順鉑等藥物為基礎(chǔ)的新輔助化療的應(yīng)用，骨肉瘤患者的5年生存率提高到約80%[4]。然而，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，其5年生存率即降為約20%[5]。這些患者的低生存率很大程度上歸因于其對(duì)化療缺乏有效反應(yīng)[6]，盡管聯(lián)合應(yīng)用新型輔助化療，仍不能有效降低骨肉瘤患者的死亡率和改善患者整體預(yù)后[7]。

骨肉瘤的耐藥機(jī)理目前尚不明確，其中一個(gè)重要原因可能是骨肉瘤內(nèi)含有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，即癌干細(xì)胞。近10年，癌干細(xì)胞已在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[8-9]。它具有成瘤、自我更新及多向分化潛能等特性，是導(dǎo)致腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[10]。癌干細(xì)胞還具有強(qiáng)抗藥性[11]，在放化療后仍能局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。骨肉瘤是一種異質(zhì)性惡性腫瘤，含有多種不同細(xì)胞，其中也包括少量癌干細(xì)胞[13]。預(yù)后較差的骨肉瘤常與癌干細(xì)胞有關(guān)。

目前，研究已證實(shí)，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可影響骨肉瘤癌干細(xì)胞的活性與功能[14]。然而，哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起關(guān)鍵作用尚不明確。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和分化，在胚胎、器官發(fā)育和維持干細(xì)胞自我更新方面起重要作用，對(duì)骨肉瘤癌干細(xì)胞也有重要影響。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?？蓪?dǎo)致骨肉瘤癌干細(xì)胞的生物特性改變，如自我更新失控、異常增殖以及分化障礙[15]。通過(guò)調(diào)控該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可改變骨肉瘤癌干細(xì)胞的特性，抑制骨肉瘤的增殖、復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這一策略有望成為骨肉瘤治療的新方向。

1 骨肉瘤癌干細(xì)胞特性

早期研究認(rèn)為，惡性腫瘤是細(xì)胞分裂形成的同質(zhì)性團(tuán)塊，每個(gè)細(xì)胞都具有相同的基因變化[16]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明惡性腫瘤是含有不同細(xì)胞級(jí)系的異質(zhì)性組織。異質(zhì)性骨肉瘤的小部分癌干細(xì)胞可能起源于單個(gè)癌干細(xì)胞，具有自我復(fù)制及分化成各種腫瘤細(xì)胞的能力[16-17]。除了有形成惡性腫瘤的潛力，癌干細(xì)胞還可在癌癥轉(zhuǎn)移部位形成新腫瘤。因此，癌干細(xì)胞已逐漸成為治療惡性腫瘤的靶點(diǎn)[13,18]。隨著分離和辨識(shí)技術(shù)的成熟，癌干細(xì)胞逐漸成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，辨認(rèn)骨肉瘤內(nèi)癌干細(xì)胞的主要方法包括細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物、側(cè)群細(xì)胞、細(xì)胞球形成等。

1.1 細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物

盡管有證據(jù)支持骨肉瘤癌干細(xì)胞的存在，但能夠成功用于辨識(shí)該細(xì)胞的標(biāo)記物較少。CD133是干細(xì)胞標(biāo)記物，現(xiàn)用于標(biāo)記部分惡性腫瘤的癌干細(xì)胞。從骨肉瘤MG63、Saos-2和U2-OS細(xì)胞系中均可分離出CD133陽(yáng)性的癌干細(xì)胞。CD133陽(yáng)性細(xì)胞可顯示干細(xì)胞樣基因表達(dá)，如表達(dá)OCT3/4、Nanog和CXCR4，形成細(xì)胞球和具有側(cè)群細(xì)胞特征。因此，CD133陽(yáng)性細(xì)胞有干細(xì)胞樣特征，表現(xiàn)出高增殖率，其細(xì)胞周期處于G2/M期，具有Ki-67陽(yáng)性高表達(dá)以及抗藥標(biāo)記物ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)G2表達(dá)增高等特性[19]。CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有較差的分化能力和較高的轉(zhuǎn)移潛能[20]，因此CD133高表達(dá)的骨肉瘤患者預(yù)后較差[21-22]?？傊珻D133是潛在的骨肉瘤治療靶點(diǎn)。通過(guò)小干擾RNA(siRNA)將CD133陽(yáng)性表型轉(zhuǎn)化為陰性表型有望成為有效的骨肉瘤治療方法。

癌干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)并非一對(duì)一模式，通常不同癌干細(xì)胞可表達(dá)同一種標(biāo)記物，也可出現(xiàn)一種癌干細(xì)胞表達(dá)不同的標(biāo)記物。癌干細(xì)胞中CD117和Stro-1多呈現(xiàn)共表達(dá)狀態(tài)，CD117和Stro-1雙重陽(yáng)性細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤和轉(zhuǎn)移能力，并對(duì)多種藥物呈抗藥性[23]。骨肉瘤癌干細(xì)胞中也可出現(xiàn)CD133和其他標(biāo)記物共表達(dá)的情況。He等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CD133和CD44雙重陽(yáng)性的骨肉瘤Saos-2細(xì)胞比任何一種標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞更易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

1.2 側(cè)群細(xì)胞

癌干細(xì)胞的抗藥性可能因?yàn)樗幬镛D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如ABC多藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)高表達(dá)所致[16],這一特點(diǎn)被用于骨肉瘤癌干細(xì)胞的鑒定[25]。觀察這些細(xì)胞對(duì)熒光DNA結(jié)合染料的排斥能力，對(duì)染料排斥的細(xì)胞為側(cè)群細(xì)胞。骨肉瘤的側(cè)群細(xì)胞顯示干細(xì)胞樣基因(Oct4,Nanog和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)上調(diào)，細(xì)胞球形成能力增強(qiáng)，以及對(duì)阿霉素、甲氨蝶呤和順鉑等多種藥物的抗藥性增強(qiáng)[26]。

1.3 細(xì)胞球形成

Gibbs等[27]首次報(bào)道骨肉瘤干細(xì)胞的成球現(xiàn)象，有成球能力的骨肉瘤干細(xì)胞可使免疫缺陷小鼠致瘤并有較強(qiáng)的抗藥性，顯示出癌干細(xì)胞的表型[28]。Martins-Neves等[29]研究發(fā)現(xiàn)，從MNNG/HOS骨肉瘤細(xì)胞系提取的癌干細(xì)胞有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，高表達(dá)Oct4、Nanog和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多能胚胎干細(xì)胞具有的表面標(biāo)記物，可誘發(fā)腫瘤形成，這些成球的癌干細(xì)胞對(duì)放化療均有較強(qiáng)的抗藥性。

以上證據(jù)表明骨肉瘤含有癌干細(xì)胞，癌干細(xì)胞在骨肉瘤的形成、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，靶向調(diào)控癌干細(xì)胞治療骨肉瘤具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2 Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)骨肉瘤癌干細(xì)胞的作用

通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)骨肉瘤癌干細(xì)胞漸已成為骨肉瘤治療的研究熱點(diǎn)。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展和維持癌干細(xì)胞的重要通路之一，通過(guò)干預(yù)該通路來(lái)影響骨肉瘤癌干細(xì)胞的生物特性，在臨床應(yīng)用方面具有良好的發(fā)展前景。

2.1 調(diào)控作用

Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可對(duì)骨肉瘤癌干細(xì)胞產(chǎn)生重要影響，但具體機(jī)制尚未明確。Yi等[30]采用Hoechst染料排斥法檢測(cè)骨肉瘤內(nèi)的癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，側(cè)群細(xì)胞中β-catenin和CyclinD1表達(dá)明顯升高，干細(xì)胞基因CD133、Oct-4、Sox2和Nanog表達(dá)也明顯增加。這些側(cè)群細(xì)胞顯示出高度的自我復(fù)制能力和高增殖率，具有高致瘤性和侵襲力。Martins-Neves等[31]研究發(fā)現(xiàn)，使用藥物(如IWR-1)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可破壞骨肉瘤癌干細(xì)胞的自我復(fù)制能力，阻礙干細(xì)胞標(biāo)記物Sox2的表達(dá)并誘導(dǎo)癌干細(xì)胞凋亡。因此，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗癌藥物可通過(guò)消除骨肉瘤癌干細(xì)胞來(lái)改善骨肉瘤的治療效果。Basu-Roy等[32]研究認(rèn)為，Sox2是顯示骨肉瘤癌干細(xì)胞自我復(fù)制的生物學(xué)標(biāo)記物，且具有拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的促分化作用。骨肉瘤內(nèi)的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制腫瘤的作用，下調(diào)Sox2可增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)成骨分化，抑制腫瘤發(fā)展。Matushansky等[33]研究認(rèn)為，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促使間充質(zhì)干細(xì)胞形成惡性纖維組織細(xì)胞瘤，而正常Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促使間充質(zhì)干細(xì)胞形成成熟的結(jié)締組織。他們認(rèn)為，抑制Sox2表達(dá)或增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為治療骨肉瘤的新途徑。

以上研究結(jié)果的不同可能與研究中的干細(xì)胞類(lèi)型不同有關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是促進(jìn)還是抑制腫瘤的形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及抗藥性取決于癌細(xì)胞類(lèi)型和發(fā)展階段，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?？膳c其他致癌或抑癌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化共同作用，影響癌癥的形成和發(fā)展[34]。

2.2 療效及安全性

目前，化療可有效縮小骨肉瘤體積，但對(duì)癌干細(xì)胞的作用不明顯。癌干細(xì)胞對(duì)多種化療藥物呈明顯抗藥性[13]，治療停止后癌干細(xì)胞可通過(guò)自我增殖導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。此外，部分化療藥物在殺傷骨肉瘤細(xì)胞的同時(shí)也可刺激某些骨肉瘤非癌干細(xì)胞逆分化為癌干細(xì)胞，從而增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的抗藥性[35]。同一腫瘤的癌干細(xì)胞可能有不同品系，對(duì)藥物產(chǎn)生不同反應(yīng)，因此，精準(zhǔn)殺滅癌干細(xì)胞是治療骨肉瘤的重要研究方向。有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進(jìn)非癌干細(xì)胞向癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)變[30]，因此，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是治療Wnt/β-catenin高表達(dá)骨肉瘤的有效途徑[31,36-37]。研究認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制因子IWR-1能有效降低骨肉瘤對(duì)阿霉素的抗藥性[31]。IWR-1通過(guò)破壞β-catenin對(duì)癌干細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，其與阿霉素共同作用可降低胞核β-catenin和癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物Sox2的表達(dá)，顯著抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)。但Krause等[38]研究認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗劑DKK1可增強(qiáng)骨肉瘤的促腫瘤形成特性，這可能與上調(diào)應(yīng)激反應(yīng)酶、癌干細(xì)胞標(biāo)記物乙醛脫氫酶1家族成員(ALDH1)A1有關(guān)。以上結(jié)果提示，不同的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑除抑制轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，還可通過(guò)其他途徑作用于癌干細(xì)胞，產(chǎn)生不同效果。至于單獨(dú)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)骨肉瘤癌干細(xì)胞的作用尚待進(jìn)一步研究。

除癌干細(xì)胞外，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)正常胚胎和成人干細(xì)胞同樣具有重要作用。這些干細(xì)胞也具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，能夠形成骨、軟骨、脂肪和其他類(lèi)型的細(xì)胞[39]。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也可干擾正常干細(xì)胞，造成嚴(yán)重不良反應(yīng)。在骨組織中，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可激發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，是新骨形成的重要途徑[40]。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑可抑制成骨細(xì)胞骨形成，使骨量明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松并誘發(fā)脆性骨折[41]。因此，對(duì)于抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療骨肉瘤應(yīng)權(quán)衡利弊。從目前的研究來(lái)看，并非所有骨肉瘤都需采用抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療，只有對(duì)于高表達(dá)該信號(hào)者，必要時(shí)可采用該方法作為輔助治療，而對(duì)嚴(yán)重骨質(zhì)疏松患者需慎重。最理想的方法是僅靶向抑制癌干細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而不影響正常干細(xì)胞。

3 小結(jié)

目前，骨肉瘤治療主要為手術(shù)切除結(jié)合新型輔助化療。然而，骨肉瘤的癌干細(xì)胞可能對(duì)放化療產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致部分患者治療效果不理想。靶向抑制癌干細(xì)胞可能是治療骨肉瘤的重要途徑。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨肉瘤癌干細(xì)胞的自我更新、分化及成瘤中發(fā)揮重要作用，因此，抑制該通路有望破壞骨肉瘤癌干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，為治療難治性及復(fù)發(fā)性骨肉瘤提供新途徑。然而，抑制該通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞(包括癌干細(xì)胞)的治療方案并非適用于所有患者，只有對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高表達(dá)者可試用作為輔助治療。此外，抑制該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也可能損害正常干細(xì)胞的功能，造成嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，對(duì)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療骨肉瘤的指征及利弊尚需作進(jìn)一步研究。