姚立帥， 王慧芳， 鄭燕芳， 陳群清

南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 1胸心外科， 3腫瘤中心(廣東廣州 510280)； 2廣東省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科 (廣東廣州 510080)

環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNA)因其呈環(huán)狀而得名，是一類種類繁多的非編碼RNA。它廣泛且穩(wěn)定地存在于生物界，是一種比線性mRNA含量更為豐富的轉(zhuǎn)錄本，能夠通過多種分子在細胞各個階段起調(diào)控作用，并與心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腫瘤等多種危害人類健康的疾病相關(guān)。本文將對circRNA在實體腫瘤中的研究進展作以下綜述。

1 circRNA的歷史及特點

1.1 circRNA的研究歷史 30多年前，Sanger等[1]首先通過電子顯微鏡在植物病毒中發(fā)現(xiàn)真核RNAs可以以環(huán)狀形式存在，隨后Kos等[2]在丁型肝炎病毒中同樣發(fā)現(xiàn)circRNA存在。接著研究者在人類的E-Twenty-Six-1基因(Ets-1)[3]和小鼠的Sry基因[4]中鑒定出內(nèi)源性circRNA是由既往已知信使核糖核酸(mRNA)加工合成的，尤其側(cè)翼序列中反向序列的存在是小鼠Sry基因循環(huán)的關(guān)鍵[5]，特別是在較長的外顯循環(huán)更為顯著[6]。來自反向剪接外顯子的大多數(shù)circRNA是穩(wěn)定的，并大多存在于細胞質(zhì)中[7]，這是由于它們對細胞線性RNA衰變機制存在抗性。然而，與線性RNA相比，circRNA的轉(zhuǎn)錄表達水平較低[8]。生物信息學分析顯示，反向剪接的外顯子通常側(cè)接較長的內(nèi)含子，并且側(cè)翼內(nèi)含子中非自主的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Alu元件)的存在被計算預測與人circRNA的形成高度相關(guān)[7]。在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定了由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子產(chǎn)生的circRNA，并作為調(diào)節(jié)性“miRNA海綿”起作用[9]，其在心血管疾病、朊病毒、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤中也不斷被驗證發(fā)揮著巨大的作用。

1.2 circRNA主要特點 circRNA分子種類繁多，數(shù)目龐大，且分布廣泛，從真核、原核生物到病毒，從果蠅到人類，從細胞質(zhì)、細胞核到人類分泌物都能發(fā)現(xiàn)大量circRNA，circRNA的表達在各物種之間高度保守[7-10]，但是在同一種族的各細胞之間卻具有特異性，同時細胞中的circRNA會隨著細胞周期進程發(fā)生變化；細胞質(zhì)中的circRNA占大多數(shù)，并主要為外顯子來源，內(nèi)含子來源以及外顯子內(nèi)含子共同組成的circRNA主要存在于細胞核內(nèi)[8]；circRNA由于缺乏易被降解的poly尾端以及通過RNA折疊使其具有高穩(wěn)定性[7, 11]。正常情況下其半衰期一般超過48 h，但是由于存在對RNA內(nèi)切酶的抵抗使在血清中只有15 s，此外由于缺乏RNA套索特征結(jié)構(gòu)的2-5鏈使其對RNA脫支酶也同樣具有抵抗力；circRNA比相關(guān)的線性mRNA更穩(wěn)定[7]。

1.3 circRNA形成機制 circRNA由特殊的前體mRNA經(jīng)各種可變剪接產(chǎn)生，主要包括3種：(1) 經(jīng)套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化形成的外顯子來源circRNA，前者由外顯子組成的剪接供體和剪接受體共價結(jié)合后切除內(nèi)含子而形成circRNA，后者由兩個內(nèi)含子通過堿基互補配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后切除內(nèi)含子而形成 circRNA；(2)內(nèi)含子通過形成索套結(jié)構(gòu)后發(fā)生部分降解而產(chǎn)生的內(nèi)含子來源circRNA；(3)在剪接過程中外顯子發(fā)生環(huán)化并同時保留了內(nèi)含子的外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA[8, 10, 12]。而產(chǎn)生circRNA的一種特殊的方式是通過“反向剪接”，其中剪接供體與上游剪接受體結(jié)合而不是正常剪接反應中與下游受體結(jié)合。這導致外顯子跳過并產(chǎn)生含有被跳過的外顯子的circRNA。反向剪接發(fā)生頻率很低，但當剪接供體和受體通過RNA二級結(jié)構(gòu)或蛋白結(jié)合在一起時可以促進反向剪接[12]。

2 分子生物學功能

2.1 miRNA海綿 “miRNA海綿”機制是目前研究比較透徹的機制，該機制提出一些circRNA上具有特定miRNA的靶點位，可以特異性地結(jié)合miRNA，以提高相應mRNA的胞內(nèi)濃度，調(diào)節(jié)細胞功能[9]，在腫瘤中常常表現(xiàn)為腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的改變，目前研究比較多的是CiRS-7[13-14]，這是一種帶有大量miR-7結(jié)合位點的circRNA，主要和腦發(fā)育相關(guān)，并通過此途徑調(diào)節(jié)CDRlas，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)。在提出基因海綿機制之后，便出現(xiàn)了環(huán)狀miRNA海綿是否是普遍的現(xiàn)象這樣的問題，繼而引發(fā)探索性試驗，研究員通過預測，找到了睪丸特異性Sry RNA中有16個推測的miRNA靶位點，通過一系列敲低和過表達等試驗證明了環(huán)狀Sry RNA可以作為miR-138海綿的結(jié)論,繼而得到環(huán)狀miRNA海綿是一種比較普遍的功能[13]。

第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院肝膽外科研究所根據(jù)既往基因海綿機制，結(jié)合已知的外泌體作用特點(外泌體是一種具有脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)的納米級小泡[15-16]，由多種細胞主動分泌[17]，小泡內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNAs、lncRNAs和circRNAs[18]，腫瘤細胞可以在發(fā)生發(fā)展過程中不斷釋放外泌體[19]，影響細胞通訊，并且調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進增殖和遷移[20]，外泌體廣泛分布于體液中，可被其他細胞所吸收[21-23])，敏銳察覺出血漿中外泌體中非編碼circRNA異常，極有可能和腫瘤有關(guān)，通過實驗進一步證明了，胰腺癌細胞產(chǎn)生大量circ-IARS，并通過外泌體方式排出細胞，被內(nèi)皮細胞吸收，通過基因海綿的作用機制結(jié)合內(nèi)皮細胞的miR-122,抑制其表達，減輕其對靶基因小G蛋白超家族的亞家族成員RhoA的抑制，減少了ZO-1和肌動蛋白的表達，從而改變了內(nèi)皮細胞的通透性，此過程影響了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，極有可能成為胰腺癌早期診斷和預后檢測的重要指標，此思路也指導我們要從更多路徑去考慮、探索基因海綿的作用機制[24]。

2.2 調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白 隨著研究的深入，相關(guān)試驗的數(shù)據(jù)有力地證明了circRNA是經(jīng)轉(zhuǎn)錄來的。circRNA通常由剪接體產(chǎn)生，剪接體進一步涉及到circRNA的生產(chǎn)。因為環(huán)狀結(jié)構(gòu)非常依賴于包圍外顯子的規(guī)范的剪接位點，因此,側(cè)翼外顯子的線性剪接可以與circRNA相競爭。這些競爭效應是非常強的，甚至可以將circRNA水平降低一個數(shù)量級。側(cè)翼內(nèi)含子序列是確定給定外顯子的環(huán)化效率的主要因素。與相似內(nèi)含子長度的對照基因相比，攜帶circRNA的基因的剪接效率較低。試驗數(shù)據(jù)表明線性拼接和circRNA生產(chǎn)可以相互調(diào)節(jié)并競爭剪接位點。事實上，大多數(shù)circRNA的主要影響的是對宿主mRNA的線性剪接。研究員的試驗數(shù)據(jù)也證明了RNA拼接蛋白(MBL)在circMbl生物合成中發(fā)揮直接作用，circMbl側(cè)翼的內(nèi)含子具有許多MBL結(jié)合位點，這對于依賴于MBL水平的外顯子的環(huán)化是必需的。當?shù)鞍踪|(zhì)過量時，其通過促進circMbl產(chǎn)生而降低其自身mRNA的產(chǎn)生，然后circRNA可以綁定多余的MBL蛋白。剪接因子可以通過抑制或增強循環(huán)外顯子上游的基因內(nèi)區(qū)的剪接來實現(xiàn)circRNA生物發(fā)生和規(guī)范剪接之間的平衡[25]。

2.3 宿主基因轉(zhuǎn)錄率 研究員在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了一類與人類細胞中的RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)聯(lián)的circRNA。在這些circRNA中，外顯子與保留在外顯子之間的內(nèi)含子環(huán)化;我們稱它們?yōu)橥怙@子-內(nèi)含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNAs主要定位在細胞核中，與U1小核RNA (U1 snRNP)相互作用并促進其親本基因的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果揭示circRNA可以調(diào)節(jié)細胞核中的基因表達，其中EIciRNAs可以增強基因順式表達，并通過特定RNA-RNA相互作用達到目的。EIciRNAs可以通過U1 snRNA和EIciRNA之間的RNA-RNA相互作用產(chǎn)生復合物，然后EIciRNA-U1 snRNP復合物可以進一步與Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄復合物啟動子相互作用，增強親本基因表達。一旦基因的轉(zhuǎn)錄開啟，EIciRNA從基因的生成將進一步促進基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生積極的反饋。U1 snRNA的常規(guī)功能是剪接，但額外的證據(jù)表明U1 snRNP具有其他作用，如刺激早期轉(zhuǎn)錄事件，防止過早的聚腺苷酸化和確定啟動子方向。ncRNA之間的特異性RNA-RNA相互作用，例如U1 snRNA和EIciRNA之間的相互作用是ncRNAs的功能機制的核心[26]。

2.4 翻譯 circRNA缺乏帽子結(jié)構(gòu)以及poly尾，兩個特征是線性mRNA有效翻譯所必須的[27]。帽子結(jié)構(gòu)被真核起始因子識別，使得其可以掃描帶有起始密碼子的mRNA。在既往文獻中提到，circRNA翻譯必須有核糖體的替代機制存在，即內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件，其直接結(jié)合起始因子或核糖體本身，這種方法被多種病毒使用以確保它們自己的翻譯以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式發(fā)生， Sarnow實驗室在1995年的開創(chuàng)性工作表明，腦心肌炎病毒(EMCV)IRES可以在體外驅(qū)動人工circRNA的翻譯[27-28]。大量實驗提供了circRNA翻譯的證據(jù)：(1)circRNA與翻譯核糖體的特異性結(jié)合；(2)產(chǎn)生來自circRNA小基因的蛋白質(zhì)；(3)發(fā)現(xiàn)在circMbl中支持終止密碼子的RFP讀數(shù)；(4)存在能夠促進幾個circRNA上的帽獨立翻譯的序列；(5)發(fā)現(xiàn)肽匹配circbl3，但沒有已知的線性同種型；(6)通過western印跡檢測推定的circMbl編碼的蛋白質(zhì);(7)測定生理因素可以調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平。并且在實驗中發(fā)現(xiàn)circRNA翻譯的一些特點：在熱休克條件下增加，提示了 circRNA編碼的蛋白質(zhì)可能在應激反應中發(fā)揮作用。通過IRES的不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的翻譯在癌癥中增加以促進其應激反應，并在增殖、凋亡和細胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用，因為circRNA只能通過帽獨立翻譯來完成翻譯過程，我們推測來自circRNA的翻譯可能在癌細胞中更普遍[29-30]。

2.5 復雜串擾功能 circRNA可以作為ceRNA，即miRNA海綿發(fā)揮作用，從而吸附相關(guān)的miRNA。一旦circRNA通過急性治療(例如，用siRNA，shRNA，ASO或LNA GapmeR)，其所連接的miRNA被釋放并游離以結(jié)合和抑制ceRNA。作為急性干預的最終結(jié)果，ceRNA被下調(diào)[31]。在不同的情況下，由于慢性治療或敲除，長期缺乏circRNA海綿導致其結(jié)合miRNA轉(zhuǎn)錄后機制出現(xiàn)不穩(wěn)定。因此，其他ceRNA靶向性下降并且表達增加[32]。

3 在疾病中的生物學作用

3.1 肝癌 在研究中發(fā)現(xiàn)Twist1可以通過circ-10720吸附miRNA介導的間接途徑調(diào)節(jié)波形蛋白的表達。敲低circ-10720之后減弱了Twist1對肝癌細胞波形蛋白表達的影響。在PDX和DEN誘導的TetOn-Twist小鼠HCC模型中，通過腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射用si-circ-10720處理小鼠，結(jié)果顯示，沉默circ-10720阻斷了Twist1對波形蛋白表達和促進HCC惡性和轉(zhuǎn)移的作用。這些結(jié)果證明了Twist1對波形蛋白的間接調(diào)控機制，并指出了circRNA在EMT中的重要作用。并通過病理分析HCC組織標本證明了，circ-10720與不良預后和腫瘤進展相關(guān)，circ-10720可能成為HCC的潛在生物標志物[33]。

3.2 膠質(zhì)瘤 該研究通過膠質(zhì)瘤與配對的正常腦組織比較，發(fā)現(xiàn)了Notch信號通路在腫瘤組織中顯著上調(diào)。確定了circNFIX可能充當了miR-34a-5p的海綿，miR-34a-5p是一種靶向NOTCH1的miRNA。circNFIX的下調(diào)和miR-34a-5p的上調(diào)均抑制細胞增殖和遷移。而且，在體內(nèi)證明si-circNFIX可以通過調(diào)控miR-34a-5p通過靶向Notch信號通路抑制膠質(zhì)瘤生長[34]。

3.3 乳腺癌

3.3.1 circ-Dnmt1與乳腺癌 最新研究發(fā)現(xiàn)circ-Dnmt1在人乳腺癌細胞中顯著高表達。circ-Dnmt1的表達不僅增加了細胞增殖和存活，但也刺激細胞自噬，抑制細胞衰老和增加腫瘤生長。這些效應可以通過直接與p53和Auf1結(jié)合，并促進它們的核轉(zhuǎn)位來調(diào)節(jié)。據(jù)我們所知，細胞質(zhì)p53抑制自噬，而核p53可以增強自噬，p53和Auf1的核轉(zhuǎn)位將誘導細胞自噬和Dnmt1表達增加，并且抑制了p53轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，circ-Dnmt1的表達增加導致了p53轉(zhuǎn)錄的抑制，這是circ-Dnmt1在增強細胞自噬、減少細胞衰老和促進細胞增殖、存活和腫瘤生長中的主要作用方式[35]。

3.3.2 circ-Ccnb1與乳腺癌 據(jù)以往研究我們得知了突變型p53不能結(jié)合H2AX。Bclaf1是一種H2AX依賴性的腫瘤抑制因子，最新研究發(fā)現(xiàn)在p53突變細胞中，circ-Ccnb1與H2AX和Bclaf1形成復合物，可以促進癌細胞死亡。這個過程只發(fā)生在p53突變細胞中，因為在野生型p53細胞中，野生型p53具有更強的結(jié)合H2AX的能力，從而使Bclaf1與Bcl2結(jié)合，Bclaf1與Bcl2的結(jié)合將促進細胞增殖。這種結(jié)合在突變型p53存在時被破壞，其中Bclaf1可以與H2AX和circ-Ccnb1相互作用，誘導p53突變型癌細胞死亡[34]。

研究結(jié)果證實了circ-Ccnb1對p53野生型細胞沒有影響，因為它實際上可以增強p53野生型細胞的增殖和存活。正是基于這一點，這種潛在的藥劑將大大降低對使用這種方法進行癌癥治療的患者的周圍基質(zhì)組織和健康細胞的影響，將是一種效果顯著但是不良反應極小的良藥。

3.4 膀胱癌 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)circ-ITCH在BCa組織和細胞系中均下調(diào)。BCa患者的circ-ITCH表達水平低，生存期會出現(xiàn)相應縮短。體外/內(nèi)的實驗同樣證明，circ-ITCH可以抑制細胞的增殖、遷移和侵襲。并最終證明了circ-ITCH通過海綿化miR-17和miR-224，上調(diào)了miR-17和miR-224靶基因p21和PTEN的表達，從而抑制BCa的侵襲性[36]。

3.5 肺癌新型液體活檢生物標志物 血漿F-circEA的檢測是一種監(jiān)測EML4-ALK易位患者的特異性較高且比較方便的方法，可以指導EML4-ALK靶向的NSCLC治療，F(xiàn)-circEA、EML4-ALK線性轉(zhuǎn)錄物和融合蛋白不同，其可以促進細胞遷移和侵襲，從而有助于腫瘤發(fā)展。這些結(jié)果增加了EML4-ALK融合基因?qū)δ[瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)。值得注意的是，F(xiàn)-circEA特異性存在于EML4-ALK陽性NSCLC患者的血漿中的證據(jù)表明F-circEA可以是一種新型“液體活檢”生物標志物，用于監(jiān)測NSCLC中的EML4-ALK融合基因[37]。

4 展望

針對circRNA的研究越來越多，從最初的無效的基因剪接到存在復雜的生理過程，circRNA發(fā)揮不可替代的調(diào)節(jié)功能。circRNA成為眾多疾病潛在診斷和治療靶點，從最初的基因海綿(從心腦血管疾病幾乎擴展到全身各種疾病)、結(jié)合蛋白、影響基因轉(zhuǎn)錄到發(fā)現(xiàn)可以翻譯、通過外泌體影響正常細胞等。盡管我們通過疾病發(fā)現(xiàn)某些基因的異常表達，但是其在正常細胞中是如何發(fā)揮作用的我們還不得而知。因此，我們能否通過血液中的circRNA表達差異發(fā)現(xiàn)疾病，通過藥物控制血液中的circRNA達到控制疾病和治療疾病的目的，又能否通過局部治療改變局部circRNA的濃度以達到改變疾病進程的目的，這些都是我們的研究目標。同時我們也必須要認清現(xiàn)實，我們所探究的circRNA還只是冰山一角，隨著科技和研究手段的發(fā)展和進步，必定有更加重要的功能被發(fā)現(xiàn)，在疾病的預防、診斷和治療中發(fā)揮更大的作用。