毛明鋒 雷文暉 周麗美 金烈

腎小管間質(zhì)損傷是糖尿病腎病進(jìn)展為終末期腎病的重要病理改變，然而目前臨床尚無有效的方法阻斷腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展。采取中醫(yī)中藥治療對糖尿病腎病患者而言意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，中藥紅芪的提取物紅芪多糖（HPS）具有一定的腎臟保護(hù)作用?；诖?，本研究以肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）為觀察指標(biāo)，探討紅芪多糖對糖尿病小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)及對腎小管間質(zhì)損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 11周齡雄性SPF級2型糖尿病db/db小鼠32只，體重（33±5）g；11周齡雄性 SPF級 db/m 小鼠（db/db小鼠的對照）8只，體重（20±3）g；兩種小鼠均購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠在室溫20～24℃的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)籠中以嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料飼養(yǎng)，每籠6只。紅芪多糖購于陜西西安天瑞生物科技有限公司，純度80%。α-SMA抗體購于美國CST公司。SDSPAGE凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶有限公司；SP檢測試劑盒購于杭州以恒生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海恪敏生物科技有限公司。石蠟切片機(jī)為德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品（型號(hào)：RM2235），光學(xué)顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品（型號(hào)：DMD108），攤片機(jī)為湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品（型號(hào)：TKD-TK）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和處理 db/db小鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)10d，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病模型組、HPS高劑量組、HPS中劑量組、HPS低劑量組，每組各8只；另擇8只db/m小鼠作為正常對照組。HPS高劑量組、HPS中劑量組、HPS低劑量組小鼠分別給予HPS 400、200、100mg/（kg·d）灌胃干預(yù)，正常對照組、糖尿病模型組小鼠以等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組小鼠均連續(xù)灌胃8周，自由進(jìn)食。8周后采用斷頭法處死小鼠，留取腎臟組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 腎臟組織病理檢查 腎臟組織以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球、腎小管間質(zhì)細(xì)胞情況，評估腎小管間質(zhì)損傷程度（按腎小管間質(zhì)病變面積占腎皮質(zhì)的百分比計(jì)算）。腎小管間質(zhì)病變面積包括腎間質(zhì)單個(gè)核細(xì)胞浸潤面積+萎縮的腎小管和腎間質(zhì)纖維化的面積。腎小管間質(zhì)損傷程度分為0～3級。0級：正常；1級：＜25%；2級：25%～50%；3級：＞50%。評估由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行，觀察10個(gè)視野以上，結(jié)果不一致時(shí)由2位醫(yī)師重復(fù)確認(rèn)結(jié)果。

1.2.3 腎臟組織α-SMA表達(dá)強(qiáng)度檢測 將腎臟組織切片先用3%過氧化氫溶液清除內(nèi)源性過氧化物酶，EDTA高壓熱修復(fù)抗原，依次按試劑盒說明書進(jìn)行加入α-SMA抗體等操作步驟。按SP法行免疫組化染色，以PBS代替一抗建立陰性對照，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織α-SMA表達(dá)強(qiáng)度。α-SMA主要在腎小管間質(zhì)表達(dá)，染色為淺黃色到深棕色為表達(dá)陽性細(xì)胞。α-SMA表達(dá)強(qiáng)度評估方法：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性（-），6%～25%為弱陽性（+），26%～50%為陽性（++），51%～75%為中等陽性（+++），＞75%為強(qiáng)陽性（++++）。評估由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行，觀察10個(gè)視野以上，結(jié)果不一致時(shí)由2位醫(yī)師重復(fù)確認(rèn)結(jié)果。

1.2.4 腎臟組織α-SMA表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取各小鼠100mg腎臟組織勻漿，超聲處理10～15s裂解細(xì)胞、提取DNA與總蛋白。取20μl樣品，在95～100°C環(huán)境下變性15 min，冷卻；微量離心機(jī)內(nèi)離心5min，上樣到 SDS-PAGE 凝膠（10cm×10cm）上，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，50g/L脫脂奶粉室溫封閉1h，加入兔抗小鼠α-SMA 單克隆抗體稀釋液（1∶100）孵育，4℃過夜；TBST洗膜10 min×3次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1∶1 000），室溫孵育 2h；TBST 洗膜 10min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影。采用Image J軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。等級資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用χ2分割法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果 見圖1、表1。

由圖1可見，正常對照組小鼠腎臟組織腎小球、毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞無增生；糖尿病模型組小鼠腎臟組織可見腎小球肥大，系膜細(xì)胞增生，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，腎小管細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)可見單個(gè)核細(xì)胞浸潤；與糖尿病模型比較，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度減輕明顯，HPS中劑量組與HPS低劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度有減輕，但不明顯。由表1可見，5組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HPS高、中劑量組與糖尿病模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），HPS低劑量組與糖尿病模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），HPS高劑量組與HPS低、中劑量組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。即糖尿病模型組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度最重，除正常對照組外，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度最輕。

圖1 光學(xué)顯微鏡下5組小鼠腎臟組織病理切片所見（a：正常對照組；b：糖尿病模型組；c：HPS高劑量組；d：HPS中劑量組；e：HPS低劑量組；HE 染色，×400）

表1 5組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度比較

2.2 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)強(qiáng)度比較 見圖2、表 2。

由圖2、表2可見，5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HPS中、低劑量組與糖尿病模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），HPS高劑量組明顯低于糖尿病模型組（P＜0.05）。

2.35組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)水平比較 見圖3-4。

由圖3-4可見，5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），HPS高、中、低劑量組與糖尿病模型組均高于正常對照組（均P＜0.05），HPS低劑量組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)水平＞HPS中劑量組＞HPS高劑量組（均P＜0.05）。

3 討論

圖2 光學(xué)顯微鏡下5組小鼠腎臟組織免疫組織化學(xué)染色所見（a：正常對照組；b：糖尿病模型組；c：HPS高劑量組；d：HPS中劑量組；e：HPS 低劑量組；SP 法，×200）

表2 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)強(qiáng)度比較

圖3 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)電泳圖

圖4 5組小鼠腎臟組織α-SMA表達(dá)水平比較（與糖尿病模型組比較，*P＜0.05）

糖尿病腎病已成為國民終末期腎病的主要病因之一[1]。因此，尋找能夠阻止糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的有效方法一直是臨床研究的熱點(diǎn)。糖尿病腎病患者的腎臟組織可見腎小球肥大，基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，同時(shí)伴隨腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎小管萎縮，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化。而腎間質(zhì)纖維化的形成過程是腎小管細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞在多種因素的作用下向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程[2]。本研究以α-SMA作為肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)志物，觀察糖尿病腎病小鼠的腎小管間質(zhì)損傷程度。結(jié)果顯示，HPS干預(yù)治療后，HPS高劑量組小鼠腎臟組織腎小管間質(zhì)損傷程度明顯減輕，且發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，本研究比較了不同HPS劑量干預(yù)治療對糖尿病小鼠的腎小管間質(zhì)損傷的改善程度，結(jié)果顯示HPS高、中劑量組小鼠腎小管間質(zhì)損傷程度明顯減輕。這說明，一定劑量的HPS對糖尿病小鼠腎臟組織具有一定的保護(hù)作用。但是在本研究HPS低劑量組中沒有發(fā)現(xiàn)這種作用，可能是由于本實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間較短、未達(dá)有效作用劑量等因素的影響。

紅芪是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的著名中藥，為豆科植物多序巖黃芪的干燥根。紅芪的主要作用為固表止汗、補(bǔ)氣升陽、利水消腫[3]。HPS屬于雜多糖，是來源于紅芪的干燥根提取的多糖活性成分。已有研究表明，HPS具有多種生理學(xué)作用及延緩糖尿病腎病進(jìn)展的作用，并且表現(xiàn)出腎臟保護(hù)作用。雷豐豐等[4]對Wistar大鼠腹腔分別注射 50、100、200、400mg/kg 不同濃度的 HPS，觀察其對大鼠體內(nèi)超氧陰離子、羥自由基清除率的影響，結(jié)果表明HPS可明顯清除超氧陰離子、羥自由基，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性。金智生等[5]通過動(dòng)物模型研究HPS對糖尿病大鼠血糖、血脂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量HPS均能明顯改善糖尿病大鼠血糖水平，降低TC、TG、LDL-C水平，改善脂蛋白代謝。丁義蘭等[6]也指出HPS可降低2型糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，減輕高糖對大鼠機(jī)體免疫器官的損傷，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力。祁雪艷等[7]研究表明，HPS可能通過抑制腎小球系膜細(xì)胞上PKC蛋白的表達(dá)及增強(qiáng)TIMP-1 mRNA的表達(dá)，減緩糖尿病腎病的進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，HPS對糖尿病小鼠的腎小管間質(zhì)損傷具有保護(hù)作用，并且具有抑制α-SMA的表達(dá)的作用。本研究結(jié)果與上述研究基本相符。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HPS能夠抑制2型糖尿病db/db小鼠腎臟組織α-SMA的表達(dá)，減輕腎小管間質(zhì)損傷程度。