譚 曜 蔣 立 佟 巖 金婉芳 鐘鶯鶯 曹國洲

(寧波海關技術中心 浙江寧波315012)

硒是人體不可缺少的微量元素之一，成人最低日需量為40 μg。由于硒的主要生物活性與人類健康及動植物生長代謝關系密切，硒的藥物價值已得到普遍重視。現(xiàn)已知硒具有治癌、抗衰老功能，為治療地方?。ㄈ缈松讲?、大骨節(jié)病、大脖子病等）、貧血病、冠心病、糖尿病、心血管病、視力障礙等23 種病變的要藥［1］。有研究表明，人體內硒生物活性不僅取決于攝入的總硒量，還與硒的化學形態(tài)密切相關［2］。常見的硒形態(tài)有亞硒酸鹽［Se（Ⅳ）］、硒酸鹽［Se（Ⅵ）］、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代乙硫氨酸（SeEt）、硒代蛋氨酸（SeMet）等。由于人與動物對硒的需求量與中毒量間閾值很窄，不同硒形態(tài)的毒性亦不同。因此，定性定量分析不同硒形態(tài)對硒的安全使用具有重要意義［3］。

由于測量誤差的存在，實驗中無法得到測量結果的真值。過去對檢測結果的準確度用誤差表示，現(xiàn)在，國際上通用不確定度反映測量結果的可信程度。不確定度是與測量結果相關聯(lián)的參數(shù)，表征合理賦予被測量值的分散性［4-5］。不確定度是對測定結果的信息補充，反映了測量結果可信程度的高低，是個確定的值。一方面便于評定可靠性，另一方面也增強了測量結果間的可比性。

通過建立食品中硒形態(tài)的測定方法，按照JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》［6］《化學分析中不確定度的評估指南》［7］規(guī)定的基本方法和程序對食品中硒形態(tài)的測試結果給予不確定度評定，一方面為國家質量檢測和監(jiān)督部門提供相關數(shù)據(jù)支持，尤其當食品中硒形態(tài)的含量處于臨界值時，用含不確定度的檢測報告作為判定依據(jù)，可有效規(guī)范市場秩序，保障消費者權益［8］，另一方面也為實現(xiàn)國際檢測數(shù)據(jù)互認、全球經濟交流與發(fā)展提供不可缺少的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 材料

檸檬酸，國藥集團化學試劑有限公司；氨水，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白酶K，百靈威公司。除另有說明外，所用試劑均為優(yōu)級純，實驗用水應符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

標準儲備液：亞硒酸鹽［Se（Ⅳ）］、硒酸鹽［Se（Ⅵ）］、硒代胱氨酸（SeCys2）和硒代蛋氨酸（SeMet）標準儲備液由中國計量科學研究院提供，濃度分別為68.9、75.1、93.5 和97.9 mg/kg，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ伊虬彼幔⊿eEt）由加拿大TRC 公司提供，純度為98%，25 mg 裝。稱取0.011 2 g SeEt 固標至標準配備瓶內，去離子水定量至112 g，制成100 μg/g 標準儲備液。

標準工作液：分別稱取2.000 0 g Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMet 標準儲備液至25 mL 標準配備瓶內，用去離子水分別定量至13.680 0、15.020 0、18.700 0 和19.580 0，制成10 μg/g 標準使用液，再分別吸取10 mL 各形態(tài)標準溶液至100 mL 容量瓶中定容，配制成1.0 μg/g 標準工作液。取10 mLSeEt 標準儲備液至100 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度，得10 μg/g SeEt標準工作溶液。

分別吸取一定量的標準工作液，稀釋配制SeⅣ和SeCys2 濃度均為10、25、50、100和250 ng/g；SeⅥ為20、50、100、200 和500 ng/g；SeMet 為50、100、200、400 和1 000 ng/g，SeEt 為100、250、500、1 000 和2 000 ng/g，所有溶液為現(xiàn)用現(xiàn)配。

微孔濾膜：0.45 μm，水系（百靈威公司）；高效液相色譜議，美國Thermofisher 公司，配有脫氣機、二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱；iCAP Qc 電感耦合等離子體質譜儀，美國Thermofisher公司；水浴恒溫振蕩器，中國常州杰博森儀器有限公司；Milli-Q 超純水器，美國密理博公司；高速冷凍離心機，美國Sigma公司；渦旋混合器，德國IKA公司；分析天平，美國梅特勒托利多，精確至0.000 1 g；pH計，美國梅特勒托利多。

1.2 方法

固體試樣經粉碎均質后，準確稱取適量樣品；若是液體樣品，則需搖勻液體試樣后，準確稱取適量樣品。加入蛋白酶K溶液，37 ℃水解提取4 h。然后用液相色譜串聯(lián)電感耦合等離子體質譜儀對食品中的硒形態(tài)進行分離測定，與系列標準溶液比較定量。

1.2.1 樣品處理

準確稱取樣品1～2 g（精確至0.000 1 g），加入20 mg 蛋白酶K，20 mL 水，37 ℃水浴震蕩4 h，3000 r/min 離心10 min，取上清液經0.45 μm 水性濾膜過濾，然后實驗室溫度下待測。同樣方法做試劑空白。

1.2.2 測定條件

1.2.2.1 高效液相色譜條件

（1）色譜柱 分析柱：Hamilton PRP-x100 柱，長250 mm，內徑4.1 mm，粒度10 μm ，或相當者；保護柱：Hamilton PRP-x100。

（2）流動相 流動相B 20 mmol/L 檸檬酸溶液和流動相C 10 mmol/L 檸檬酸溶液分別用20 %氨水調節(jié)pH 至4.9。梯度洗脫條件見表1。流速：1.0 mL/min；進樣量：100 μL。

1.2.2.2 質譜條件

質譜條件見表2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

表2 ICP-MS儀器條件

1.2.3 建立數(shù)學模型

試樣中各種硒形態(tài)的含量按下式進行計算。

式中：X，試樣中不同形態(tài)硒的含量，mg/kg；Ci，測試樣液中不同硒形態(tài)的濃度，ng/mL；C0，試劑空白中不同硒形態(tài)的濃度，ng/mL；V，樣品定容體積，mL；m，樣品稱樣量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源

不確定度評定可分為不確定度A類和不確定度B 類評定。不確定度A 類評定指用對觀測列進行統(tǒng)計分析的方法來評定標準不確定度（以標準差表示的測量不確定度），是由一系列重復觀測值計算得到。主要包括以下3個來源：

（1）重復性實驗；

（2）最小二乘法擬合標準曲線校準引入的不確定度；

（3）樣品回收率。

不確定度B類評定指用不同于對觀測列進行統(tǒng)計分析的方法來評定標準不確定度，是根據(jù)有關信息來評定，即通過一個假定的概率密度函數(shù)得到。主要包括以下3個來源：

（4） 樣品前處理：包括樣品均勻性、稱重（天平的最大允許誤差）、移液槍定量、溫度引起的水膨脹系數(shù)等；

（5）標準物質：包括標準儲備液的不確定度和稀釋過程引入的不確定度；

（6）檢測儀器引入的不確定度。

使用魚骨圖系統(tǒng)分析不確定度A、B 類來源，如圖1所示。

圖1 不確定度A、B類來源

2.2 不確定度的評定

2.2.1 A類不確定度評定，u（1）

由重復觀察（精密度）引入的不確定度屬于A類不確定度［9］。

2.2.1.1 重復試驗引入的相對不確定度

以Se（Ⅳ） 為例（下同），3 次測量結果ωSe（Ⅳ）為2.86、3.04、2.97 mg/kg，算術平 均值?＝2.96 mg/kg，算術平均值的不確定度為uSe（Ⅳ）（?）相對不確定度

依據(jù)上述公式計算其他4種硒形態(tài)重復試驗引入的相對不確定度，結果見表3。

表3 重復試驗引入的不確定度

2.2.1.2 最小二乘法擬合標準曲線校準引入的不確定度

測定不同質量濃度的Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、Se-Cys2、SeEt及SeMet標準工作溶液，每個校準點測定2 次，計數(shù)值y見表4 所示。采用最小二乘法擬合標準溶液的濃度與峰面積曲線，可得到方程y＝a + bx （a 為截距，b 為斜率，x為濃度）和相關系數(shù)r，具體見表4。

依據(jù)試驗，對一濃度樣品進行2 次重復測量，c1Se（Ⅳ）＝99.94 ng/g，c2Se（Ⅳ）＝99.66 ng/g，平均濃度c0Se（Ⅳ）＝99.80 ng/g。殘差標準偏差為：

標準溶液平均濃度為：

標準溶液濃度的殘差的平方和為：

則c0Se（Ⅳ）的標準不確定度為：

式中：n，標準溶液的測量次數(shù)，本例為10；p，c0的測量次數(shù)，本例為2。

C0Se（Ⅳ）的標準不確定度為：

依據(jù)上述公式計算，其他4種硒形態(tài)線性擬合產生的相對不確定度見表5。

2.2.1.3 樣品回收率引入的不確定度

加標實驗結果顯示，5 種硒形態(tài)的回收率為a-～a+，其中Se（Ⅳ）為85.2%～94.8%、Se（Ⅵ）為90.5 %～102.2 %、SeCys2 為88.3 %～100.6 %、SeEt 為91.9 % ～101.7 % 、 SeMet 為93.1 % ～99.4 %，樣品回收率不確定度按JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》［7］附錄A.1.4 節(jié)計算。區(qū)間半寬度為：

若在區(qū)間分布均勻，取矩形分布：

樣品回收率引入的不確定度見表6所示。

2.2.1.4 A類不確定度u（1）合成

按此公式計算，5 種硒形態(tài)Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeEt 及SeMet 的A 類不確定度分 別 為3.347%、4.208%、3.908%、3.533%、2.434%。

2.2.2 B類不確定度評定，u（2）

2.2.2.1 樣品前處理過程（包括樣品均勻性、天平最大允許誤差、移液器定量誤差、溫度引起的水膨脹系數(shù)等）引入的不確定度

（1）樣品均勻性引入的不確定度 依照GB/T 5009.1-2003 《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》［10］規(guī)定，將樣品充分混勻后隨機取樣，可認為樣品是均勻、充分具有代表性，由此所引入的不確定度可忽略不計。

表4 最小二乘法擬合標準溶液濃度

表5 最小二乘法擬合標準曲線校準引入的不確定度

（2）稱重（天平的最大允許誤差）引入的不確定度 準確稱取樣品1.00 g，天平的最小分度為0.000 1 g。根據(jù)鑒定證書，該準確級的天平在0～50 g的最大允許誤差為±0.000 5 g，因樣品質量由2 次回零（空瓶和樣重）稱量所得，取矩形分布，稱重所導致的不確定度為：

（3）移液管引入的不確定度 依據(jù)JJG 646-2006《移液器》［11］規(guī)定，20 mL可調移液器取20 mL的容量允差（△）為±0.048%，取矩形分布。移液器引入的不確定度為：

表6 樣品回收率引入的不確定度 單位：%

（4） 溫度引入的不確定度 實驗室溫度為25℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，實驗室容量瓶和溶液溫度與校準時的不同引起體積變化所引入的不確定度u（△T）＝（20×2.1×10-4×5）/

urel（△T）＝0.012 12/20=0.0606%

（5） 樣品前處理過程引入的不確定度urel（pre） 由上述評定可知，樣品前處理引入的不確定度由urel（m）、urel（△V）及urel（△T）組成，合并前處理不確定度urel（pre）為：

依此公式計算，5 種硒形態(tài)Se （Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeEt及SeMet由樣品前處理引入的不確定度均為：0.078 14%。

2.2.2.2 標準物質引入的不確定度

（1）標準儲備液的不確定度 根據(jù)SeEt 固體標準品純度不小于98%，取矩形分布，由標準品純度引入的相對不確定度為1.155 %。其余4 種硒形態(tài)標準品為標準儲備液，由中國計量科學研究院提供。5 種硒形態(tài)標準品不確定度及相對不確定度詳見表7。

表7 硒形態(tài)標準儲備液相對不確定度

（2）標準儲備液稀釋過程所用天平（天平的最大允許誤差）稱重引入的不確定度 分別稱取2.000 0 g Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMet標準儲備液至25 mL 標準配備瓶內，用去離子水定量至13.680 0、15.020 0、18.700 0和19.580 0 g，制成10 μg/g 4種硒形態(tài)標準使用液。分別吸取10 mL各形態(tài)標準溶液至100 mL 容量瓶中定容，配制成1.0 μg/g標準工作液。

從SeⅣ和SeCys2 的1.0 μg/g 標準工作液分別取1（1 mL 吸管）、2.5（5 mL 吸管）、5（5 mL 吸管）、10（10 mL 吸管）和25 mL（25 mL 吸管）至100 mL 容量瓶中，用去離子水定容分別得到10 、25、50、100 和250 ng/g 的Se Ⅳ和SeCys2 標 準溶液。

從SeⅥ的1.0 μg/g 標準工作液中分別取2（2 mL 吸管）、5（5 mL 吸管）、10（10 mL 吸管）、20（20 mL 吸管）和50 mL（50 mL 吸管）至100 mL 容量中，用去離子水定容分別得到20、50、100、200和500 ng/g的SeⅥ標準溶液。

從SeMet 的1.0 μg/g 標準工作液中分別取5（5 mL 吸管）、10（10 mL 吸管）、20（20 mL 吸管）和40 mL（20 mL 吸管2 次）至100 mL 容量中，用去離子水定容分別得到50、100、200 和400 ng/g 系列SeⅥ標準溶液；直接使用1.0 μg/g標準工作液，為1 000 ng/g SeⅥ標準溶液。

稱取0.011 2 g SeEt 固標至標準配備瓶內，用去離子水定量至112 g，制成100 μg/g SeEt標準儲備液；再從100 μg/g SeEt標準儲備液中取10 mL至100 mL容量中，用去離子水定容得10 μg/g SeEt標準工作溶液。用吸管分別吸取10 μg/g SeEt標準工作溶液1（1 mL 吸管）、2.5（5 mL 吸管）、5（5 mL吸管）、10（10 mL 吸管）和20 mL（20 mL 吸管）至100 mL 容量中，再用去離子水定容分別得到100、250、500、1 000和2 000 ng/g系列SeEt標準溶液。

使用天平的最小分度為0.000 1 g，根據(jù)鑒定證書，該準確級的天平在0～50 g 的最大允許誤差為±0.000 5 g，稀釋過程各由2 次回零稱量所得（儲備液由空瓶重、標準儲液重稱量獲得，稀釋液由儲備液重及稀釋液重稱量獲得），取矩形分布。

則天平的最大允許誤差導致的不確定度由以上兩個不確定度合成：

同理，Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMet 和SeEt 稀釋過程引入的相對不確定度分別為0.041 18%、0.041 05%、0.041 04%和3.645%。

（3）標準儲備液稀釋過程所用容量器具引入的不確定度 按照標準GB 5009.93-2017 標準曲線制備步驟，配制系列硒標準溶液。測定過程中所用容量器具引入的不確定度［12］見表8所示。

表8 稀釋過程中容量器具引入的相對標準不確定度

配制Se（Ⅳ）系列標準溶液使用1 mL 吸管1次，5 mL 吸管2 次，10 mL 吸管2 次，25 mL 吸管1次，100 mL容量瓶6次。

配制Se（Ⅵ） 系列標準溶液使用2 mL 吸管1次，5 mL 吸管1 次，10 mL 吸管2 次，20 mL 吸管1次，50 mL吸管1次，100 mL容量瓶6次。

配制SeCys2系列標準溶液使用使用1 mL吸管1次，5 mL 吸管2 次，10 mL 吸管2 次，25 mL 吸管1次，100 mL容量瓶6次。

配制SeMet系列標準溶液使用5 mL吸管1次，10 mL 吸管2次，20 mL吸管3次，100 mL容量瓶6次。

配制SeEt 系列標準溶液使用1 mL 吸管1 次，5

mL 吸管2 次，10 mL 吸 管2 次，20 mL 吸 管1 次，100 mL 容量瓶6次。

（4）標準儲備液稀釋過程溫度引入的不確定度 由2.2.2.1（4）可知，由于每用一次吸管、容量瓶，溫度引入的相對不確定度均為0.060 6%。

配制Se（Ⅳ）系列標準溶液使用1mL 吸管2次，5 mL 吸管2 次，10 mL 吸管1 次，25 mL 吸管1次，10 mL 容量瓶1 次，100 mL 容量瓶5 次，共計12次。

同理，配制Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMet、SeEt標準儲備液稀釋過程溫度引入的不確定度均為0.209 9%。

（5）標準物質引入的不確定urel（sta）

依此公式計算，5 種硒形態(tài)Se （Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeEt及SeMet由樣品前處理引人的不 確 定 度 分 別 為1.146%、 1.664%、 1.438%、3.860%和1.333%。

2.2.2.3 檢測儀器引入的不確定度

依據(jù)國家計量所提供的校準證書：高效液相色譜的不確定度為0.65%。電感耦合等離子體質譜儀的不確定度9Be 為2.9 %、115In 為1.0%、229Bi 為2.5%，取最大不確定度2.9%，按矩形分布計算不確定度。

2.2.2.4 B類不確定度u（2）合成

按此公式計算，5 種硒形態(tài)Se （Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeEt 及SeMet 由B 類引入的相對不確定度分別為2.065%、2.392 %、2.240%、4.225%和2.174%。

2.2.3 總體相對不確定度μ（總）

2.2.4 試樣不確定度評價

假設置信概率為0.95，取包含因子k＝2，則擴展相對不確定度urel＝k×urel（總）

擴展不確定度為u＝?×Urel

計算食品樣品中5 種硒形態(tài)Se （Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeEt、SeMet 濃度分別為（2.96±0.23）、（0.63±0.06）、（4.39±0.40）、（6.52±0.72）、（10.48±0.68） mg/kg

食品中5種硒形態(tài)不確定度評定結果見表9。

3 討論與結論

液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯(lián)用測定食品中硒形態(tài)的含量方法簡便、快速、準確。對不確定度分量來源評定進行了更加合理的分類評定。A 類評定包括重復性實驗引入的不確定度；最小二乘法擬合標準曲線校準引入的不確定度；樣品回收率引入的不確定度。B 類評定包括樣品前處理：樣品均勻性、稱重（天平的最大允許誤差）、移液槍定量誤差、溫度引起的水膨脹系數(shù)等引入的不確定度；標準物質：包括標準儲備液的不確定度和稀釋過程引入的不確定度；檢測儀器引入的不確定度。

表9 食品中5種硒形態(tài)不確定度評定結果

不確定度評定可明確實驗室質控管理目標，通過計算食品中硒形態(tài)含量測定的擴展不確定度，可為食品中硒形態(tài)的實際監(jiān)測工作提供更科學、完整的檢測數(shù)據(jù)。

實驗過程中，由于沒有購買到SeEt 的標準儲備液，只能以固標SeEt （純度98%，25 mg 裝）來代替。因質量較小，在取樣稱量過程產生的不確定度較大。因此，應盡量選用標準儲備液，以降低不確定度。

通過表9可知，回收率、重復性實驗、儀器以及標準物質產生的不確定度較大。因此，在實際測定中，檢測人員應熟練掌握實驗操作技能、規(guī)范具體實驗操作，盡可能保證實驗結果的穩(wěn)定性和準確性。為保證儀器處在最佳工作狀態(tài)，儀器性能的維護和調試也十分重要，這是保證實驗結果準確可靠的基礎。標準曲線擬合會對不確定度帶來一定影響，因此，在實驗過程中，應當提高標準溶液配制的技術水平，降低對結果的影響，使測定結果更加準確，更接近真實值。