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        油菜單倍體遺傳轉(zhuǎn)化的條件

        2019-03-19 14:21:22
        廣東蠶業(yè) 2019年11期
        關(guān)鍵詞:單倍體花蕾孢子

        申 敏

        油菜單倍體遺傳轉(zhuǎn)化的條件

        申敏

        (長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院山西長治046000)

        小孢子作為一種單倍體材料可以進(jìn)行外源基因遺傳轉(zhuǎn)化,這種方式可以加快轉(zhuǎn)基因材料純合速度,在染色體加倍后,導(dǎo)入的外源性狀能以純合體的形式體現(xiàn)。排除了隱性干擾,提高了選擇的準(zhǔn)確性。文章從單倍體概念及原理、轉(zhuǎn)化的主要技術(shù)環(huán)節(jié)及其特點(diǎn)、后代鑒定等進(jìn)行了分析。

        單倍體;遺傳轉(zhuǎn)化;進(jìn)展

        油菜是一種重要的油料作物,現(xiàn)階段大部分研究進(jìn)行轉(zhuǎn)化的材料大都是二倍體的組織,得到的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)常是雜合體[1],在后代培養(yǎng)中容易造成外源基因的丟失,限制了在基因改良中的優(yōu)勢利用。

        小孢子或是小孢子衍生胚、花粉和小孢子培育體系在多種有重要商業(yè)價(jià)值的高等植物中已經(jīng)有過報(bào)道。依據(jù)小孢子本身的特性可以使得小孢子作為基因純合的優(yōu)良受體。在染色體加倍后,導(dǎo)入的外源性狀能以純合體的形式體現(xiàn)。這種方法還可以用來在經(jīng)過了胚胎的基因轉(zhuǎn)移和突變重新得到單個(gè)植株的同質(zhì)植株。單倍體最關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因會使轉(zhuǎn)化株馬上表達(dá)轉(zhuǎn)化性狀,簡化了遺傳分析,增加基因劑量。單倍體轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于雜交后純系品種快速繁殖。

        1 油菜單倍體轉(zhuǎn)化的外植體

        小孢子衍生的胚、單倍體莖段、莖節(jié)間、莖段、葉柄、子葉下胚軸、原生質(zhì)體和小孢子等各種外植體可以用在遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

        小孢子再生能力非常強(qiáng),后期更易獲得需的材料。剛分離的小孢子作為轉(zhuǎn)化受體選擇主花序或第一次分枝花序3~4 mm的花蕾,在油菜花藥培養(yǎng)中,只有單核晚期的小孢子可能發(fā)育成胚狀體。在開花四天摘取3~4 mm的花蕾時(shí),小孢子的發(fā)育一致性較好[2]。

        對于甘藍(lán)型油菜,從器官、組織、細(xì)胞三個(gè)水平研究了供體植株不同外植體部位再生情況及影響再生反應(yīng)的一些因素,并對甘藍(lán)型油菜小孢子來源的再生組培苗進(jìn)行了倍性水平的鑒定[2],結(jié)果表明,利用莖段節(jié)間再生腋芽是一種較好的快速再生植株方式,具有出芽快,遺傳特性保持好的特點(diǎn),莖段具有較強(qiáng)的分化芽能力,而葉柄和葉片難以誘導(dǎo)芽分化。

        2 油菜單倍體轉(zhuǎn)化的主要技術(shù)環(huán)節(jié)

        2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

        農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中LBA4404 ,EHA101 已經(jīng)成功獲得油菜轉(zhuǎn)化,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在植物轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用較為廣泛:將所需接種的工程菌接種在YEB液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)28 度震蕩過夜,培養(yǎng)至對數(shù)期離心收集菌體,然后將液體培養(yǎng)基洗滌幾次,再用NLN培養(yǎng)基重懸備用。

        小孢子進(jìn)行32 度熱激處理使用農(nóng)桿菌工程菌株侵染進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)兩天后,離心(2 000 r/min,3 min)收集共培養(yǎng)后的小孢子,將處理后的小孢子用新鮮的含100 mg/L的羧芐青霉素培養(yǎng)基暗培養(yǎng)直至小孢子長出肉眼可見的小胚狀體,再將小孢子移接到篩選壓(Kan 50 mg/L)的培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生[3]。

        農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最廣泛,適用范圍最廣的一種轉(zhuǎn)化方法,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在油菜轉(zhuǎn)化中效率也很高[3]。

        2.2 基因槍轉(zhuǎn)化或微粒轟擊法

        使用PDS-1000 型高壓基因槍轟擊小孢子,根據(jù)預(yù)定參數(shù)參照說明書操作,金粉使用量為130 ul金粉,DNA使用量為0.7 ug。轟擊以后暗處理16 h,再逐漸轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中。小孢子采用熱激處理可以產(chǎn)生較高的胚狀體分化率。

        微粒轟擊優(yōu)點(diǎn)是:適用范圍廣,精確和實(shí)用。但是這個(gè)方法在油菜中并沒有很普及,因?yàn)檗r(nóng)桿菌接到法在油菜轉(zhuǎn)化中效率同樣很高[4]。缺點(diǎn)是:高速粒子進(jìn)入細(xì)胞后會破壞細(xì)胞膜引起細(xì)胞損傷而且會導(dǎo)致乙烯積累。0.4 M甘露醇可以解決這個(gè)問題,濃度太高(0.5 M)會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。較低的粒子轟擊壓力會得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。

        2.3 影響小孢子與小孢子衍生胚再生的因素

        小孢子預(yù)處理?xiàng)l件

        (1)低溫處理及處理時(shí)間:小孢子在與工程菌株共培養(yǎng)之前先低溫處理刺激小孢子生長。

        對供體材料小孢子進(jìn)行低溫預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)小孢子胚胎再生能力顯著提高,而不同的基因型預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)低溫處理時(shí)間越長小孢子的胚發(fā)育能力下降,表示低溫處理影響小孢子的胚發(fā)育下降,胚胎發(fā)生率提高。

        (2)消毒時(shí)間與濃度:在7 %的次氯酸鈉溶液中表面消毒15 min,次氯酸鈉濃度過高則花蕾脫水失去活性,濃度偏低則易污染。

        (3)小孢子培養(yǎng)密度:在NLN13 液體培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)時(shí),小孢子最佳密度是(Φ60 mm*15 mm培養(yǎng)皿)是兩個(gè)花蕾提取的小孢子,在加入多菌靈和鏈霉素的MS培養(yǎng)基,可提高成苗率,使用滅菌水處理沖洗,沖洗后再用少量培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗。培養(yǎng)基均用0.22 um濾膜過濾滅菌。用玻璃棒將花蕾研碎。尼龍網(wǎng)過濾,離心后沉淀小孢子。

        (4)小孢子培養(yǎng)時(shí)間:小孢子培養(yǎng)三天作為轉(zhuǎn)化受體比剛分化的小孢子作為受體進(jìn)行誘變處理,培養(yǎng)三天的小孢子轉(zhuǎn)化率明顯增加,可能是培養(yǎng)三天后的小孢子已經(jīng)向胚狀體發(fā)育轉(zhuǎn)化。其它培養(yǎng)條件比如說溫度[5],蔗糖濃度不同等條件的變化對小孢子轉(zhuǎn)化率影響較小。

        培養(yǎng)溫度在25 ℃ (白天/晚上) 和16 h光周期。

        3 單倍體遺傳研究存在的不足

        采用單倍體育種最大的問題是受花期限制,和外源的化學(xué)物質(zhì)處理,例如秋水仙素用來將單倍體植株染色體加倍。通過單倍體育種得到雙單倍體這種技術(shù)并不是適用于任何物種,在有些不適用于單倍體育種技術(shù)的育種物種中,發(fā)展和啟動這種技術(shù)成本太大。

        小孢子雖然使得轉(zhuǎn)化后容易獲得純合的轉(zhuǎn)基因材料,極大縮短育種時(shí)間等顯著優(yōu)點(diǎn),但是小孢子自身的缺陷在于:(1)小孢子本身壁較厚,工程菌種侵染轉(zhuǎn)入較為困難,所以需要更多優(yōu)化措施幫助提高轉(zhuǎn)化效率;(2)小孢子受限于物種不同,開花季節(jié)取得小孢子時(shí)間受限,并且小孢子對外界條件比如遺傳因素、抗生素等因素敏感;(3)小孢子衍生胚屬于多細(xì)胞組織,轉(zhuǎn)化這些組織會產(chǎn)生嵌合體。所以高效率的小孢子轉(zhuǎn)化還需要更多深入研究。

        [1]杜志釗,陸瑞菊,黃劍華.以單倍體材料為轉(zhuǎn)化受體的植物轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2010(2):302-306.

        [2]林良斌,劉雅婷,董娜,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜大田植株小孢子[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006(05):12-17.

        [3]陸瑞菊,孫月芳,王亦菲,等. Studies on Improving Response of Microspore Culture in Barley%提高大麥游離小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的研究[J].大麥與谷類科學(xué),2004,000(002):14-16.

        [4]于曉玲,崔百明,衛(wèi)海濱,等.基因槍轉(zhuǎn)化法在棉纖維細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)外源基因的研究%Study on Transient Expression of Target Gene in the Epidermal Cells of Cotton Ovules via Particle Bombardment[J].棉花學(xué)報(bào),2007,019(006):419-423.

        [5]王煒,楊隨莊. The Initiation of Microspore Embryogenesis in Higher Plants%高等植物小孢子胚發(fā)生的啟動[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,000(001):14-20.

        申敏(1987- ),女,山西潞城人,碩士,研究方向:食品生物技術(shù)。

        S513

        A

        2095-1205(2019)11-27-02

        10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.14

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