郭志輝 韓煥欽 鄭偉強

肝功能衰竭是肝病終末期的臨床表現(xiàn)之一。現(xiàn)如今治療肝功能衰竭的人工肝治療方法依然是非生物型人工肝(Non-Bioaritificial Liver, NBAL)，非生物型人工肝不具有肝細胞合成白蛋白、凝血因子等活性物質(zhì)的功能，但生物型人工肝(Bioaritificial Liver, BAL)卻很好地彌補了非生物型人工肝在合成、分泌方面的不足。本文主要介紹了生物型人工肝的干細胞的來源、誘導分化以及生物型人工肝的臨床應用。作為肝功能衰竭的有效治療方式，生物型人工肝必將成為今后研究和應用的熱點。

肝炎病毒、藥物、酒精、自身免疫性疾病等多種因素可導致急性、慢性肝衰竭，而肝衰竭后期患者病死率大于50%[1]，目前肝衰竭的治療方法主要還是內(nèi)科綜合治療、非生物型人工肝支持治療及肝臟移植等。內(nèi)科綜合治療主要以藥物治療，但未能立即緩解患者病情，而非生物型人工肝能明顯有效地清除患者體內(nèi)毒素及代謝廢物，改善患者內(nèi)環(huán)境、凝血功能，緩解黃疸、皮膚瘙癢、肝性腦病、腹水等癥狀體征，但由于其價格昂貴、無法降低患者病死率，所以只能用于緩解急慢性肝衰竭癥狀或橋接肝臟移植手術(shù)[2]。研究表明，肝臟移植手術(shù)是目前大部分急、慢性肝衰竭的唯一有效治療手段[3]，但肝臟供體來源不足一直是限制肝臟移植手術(shù)的主要因素[4]。

近年來研究指出，生物型人工肝能夠清除急、慢性肝衰竭患者體內(nèi)代謝性廢物，降低血清氨、膽紅素的水平，以及合成肝臟的活性物質(zhì)，如凝血因子、纖維蛋白原、白蛋白等[5]，并促進肝衰竭患者的肝細胞再生，彌補了非生物型人工肝的不足[5]。生物型人工肝使用的細胞來源之一就是干細胞[5-6]，本文就干細胞的來源、誘導分化、生物型人工肝的應用進行綜述。

一、干細胞的來源、誘導以及分化

干細胞包括人胚胎干細胞 (Human Embryonic Stem Cells, HESCs)、誘導人多能干細胞 (Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs) 和人間充質(zhì)干細胞( Human Mesenchymal Stem Cells, HMSCs) 等，人間充質(zhì)干細胞又包括骨髓間充質(zhì)干細胞 (Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)、造血干細胞、肝臟干細胞和脂肪干細胞(Adipose Stem Cells, ASCs)等。

HESCs來源于人類早期受精卵的內(nèi)細胞團，Thomson等[7]研究指出HESCs能高水平地表達端粒酶活性，能夠以未分化的細胞狀態(tài)在體外無限增殖，并保持內(nèi)胚層、中胚層、外胚層的各個組織的分化潛能。在人胚胎干細胞系BG01V/hOG培養(yǎng)基中加入生長因子及制瘤素M后可檢測出白蛋白的高度表達，意味著HESCs沿肝臟譜系分化成肝細胞樣細胞[8]。即使經(jīng)過長時間的體外培養(yǎng)和冷凍保存，HESCs產(chǎn)生的功能性肝細胞樣細胞仍保持穩(wěn)定的生理活性，在四氯化碳誘導的纖維化大鼠肝臟中移植冷凍保存的HESCs衍生的肝祖細胞后有顯著的治療效果，包括改善大鼠的肝組織學和肝酶的生物化學指標以及增加大鼠的存活率，這一研究結(jié)果對臨床應用HESCs衍生的肝譜系細胞有著重要的指導作用，但使用HESCs面臨著倫理道德的爭議[9]。

HIPSCs是從人體中的體細胞提取而來，并經(jīng)過重編誘導形成的具有自我更新能力及分化成任何類型細胞的潛能。2007年前人類多能干細胞(Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs)的唯一來源是HESCs[10]，但有研究表明，Takahashi和Yamanaka2007年研究證實可以通過整合逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導了四種確定的基因OCT3 / 4，SOX2，KLF4和C-MYC，并誘導重編成人面部真皮成纖維細胞產(chǎn)生HIPSCs[11]，通過實驗表明，有可能完全從HIPCs誘導產(chǎn)生初期肝臟細胞組織[12]。此外，HIPSCs在形態(tài)學、增殖、表面抗原、基因表達、多能細胞特異性基因的表觀遺傳狀態(tài)和端粒酶活性方面與HESCs相似，HIPSCs技術(shù)的出現(xiàn)給科學家們提供了人類胚胎樣干細胞的同時也避免了許多有關(guān)使用HESCs的道德限制[10]。通過在培養(yǎng)基中加入表皮生長因子、血管生長因子及肝細胞生長因子，干細胞衍生的肝臟組織顯示肝功能超過365 d，未來可作為臨床的肝臟組織來源或體外肝臟功能支持[13]。

HMSCs存在于人類的各種組織中，具有分化成原有組織細胞或其他組織細胞的潛能，并具有再生、修復組織損傷等功能。人胎兒間充質(zhì)干細胞從多種組織提取而來，包括胎兒前三個月的血液、肝臟、脂肪組織、骨髓以及胎盤、臍帶、羊水中分離提取[14-18]，研究表明，在某些條件下，HMSCs可以在體外和體內(nèi)分化成許多細胞類型，包括肝細胞[19]。迄今為止已經(jīng)開發(fā)了四種主要方法來誘導HMSCs向肝細胞的轉(zhuǎn)分化，分別為更改相應化學化合物和細胞因子，進行遺傳修飾以及微環(huán)境的調(diào)整，改變培養(yǎng)HMSCs的物理參數(shù)從而實現(xiàn)間充質(zhì)細胞向肝細胞的轉(zhuǎn)變。HMSCs轉(zhuǎn)化成肝細胞的同時HMSCs也通過旁分泌分泌營養(yǎng)因子，以及與細胞增殖有關(guān)的細胞因子和生長因子，從而減少肝細胞凋亡的數(shù)量，起到使肝損傷患者肝臟細胞再生，改善患者肝功能的作用[20]。

二、生物型人工肝

BAL是由生物反應器及裝置內(nèi)的分離培養(yǎng)的肝細胞或功能性肝細胞組成，在體外具有肝臟的解毒、轉(zhuǎn)化、生物合成及分泌等功能。BAL目前有體外肝臟輔助裝置(Extracorporeal Liver Assist Device, ELAD)系統(tǒng)及生物人工肝支持系統(tǒng)(Bioartificial Liver Support System, BLSS)等[21]。ELAD適合血流動力學及腦灌注壓不穩(wěn)定、凝血功能障礙、肝性腦病的患者，能有效降低血氨，改善神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，在芝加哥大學的初始臨床試驗中，ELAD系統(tǒng)為多個裝有100 g永生化人肝細胞的中空纖維濾筒盒及血液泵組成，治療5例暴發(fā)性肝衰竭患者，在治療過程中停用血管收縮藥物及降低吸入氧氣濃度后，血流動力學(腦灌注及平均動脈血壓)穩(wěn)定，治療期間患者不需要輸注任何血液制品，因此可避免血液疾病的傳播，5例患者均經(jīng)歷了257 h的治療，證明該ELAD能維持功能并連續(xù)長時間使用，延長所有患者生存時間并成功實施肝移植手術(shù)，但治療人數(shù)較少，而應進行更大規(guī)模的隨機試驗驗證該實驗結(jié)果[22]。ELAD在另一項III期臨床試驗中使用人肝母細胞瘤細胞系HepG2/C3A(100 g)治療96例酒精性肝功能失代償期患者，治療91 d后血肌酐<1.3 mg/dL，國際標準化比值(INR)≤2.5，存活率為93.9%，而對照組為68.4%[23]。

BLSS系統(tǒng)也是由中空纖維濾芯生物反應器及血泵組成，約70～100 g豬肝細胞被放置于生物反應器的外腔中。首次應用BLSS進行Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗治療1例41歲的非洲裔美國女性特發(fā)性暴發(fā)性肝衰竭伴肝性腦病患者，BLSS灌注期間仍能保持凝血功能，但每次開始灌注時患者出現(xiàn)短暫性低血壓、血糖降低及血小板減少10%，灌注后期血壓及血小板恢復正常，血糖降低機制尚未清楚。BLSS在第2次灌注時可迅速清除血氨、乳酸，降低血清總膽紅素、ALT、AST的水平，有效提高氧合指數(shù)，改善呼吸功能，灌注期間神經(jīng)精神系統(tǒng)未見惡化。BLSS治療后患者血液生化指標得到明顯改善,其中白蛋白含量升高，凝血酶原時間、INR明顯趨向正常。BLSS適用于乳酸、血氨明顯升高合并凝血功能異常的肝性腦病患者，但缺點是無法清除肌酐和尿素氮[24-25]。

三、干細胞用于BAL的臨床療效

為探討新型BAL的免疫安全性，張悅等使用豬肝細胞-骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作為反應細胞，以乳糖酰基殼聚糖納米纖維支架的多層平板作為生物反應器用于治療D氨基半乳糖誘導的比格犬急性肝衰竭模型，實驗組接受治療后各個臟器均未檢測出免疫球蛋白IgM、IgG及補體C3的沉積，顯示出該BAL具有良好的免疫安全性[26]。

由人胎兒成纖維細胞重編程誘導得到人功能性肝細胞(human induced functional hepatocytes，hiHeps)并用于hiHep-BAL系統(tǒng)，hiHep-BAL系統(tǒng)的組件包括三個滾子泵，肝素泵，血漿過濾器，血漿成分分離器和多層平板生物反應器(中空柱支架及65層圓形平板組成，均由聚碳酸酯制成)，用于治療D-半乳糖胺誘導的急性肝功能衰竭豬模型，與對照組比較，hiHep-BAL組處理的豬在第3天檢測血液生化結(jié)果提示氨和總膽紅素的血清水平明顯降低，凝血酶原時間、AST、ALT下降趨勢明顯，以及通過合成分泌人白蛋白的活性顯示代謝解毒能力并顯示出改善急性肝衰竭豬存活率的治療效果，第5天肝性腦病癥狀得到明顯緩解，在組織學、基因表達分析顯示hiHep-BAL組豬的炎癥細胞因子TNFα和IFNγ的表達及炎癥細胞因子的mRNA水平顯著下調(diào)，表明炎癥反應消退及肝細胞的死亡減少，此外在第7天可檢測到豬肝增殖細胞及增殖的基因，豬肝組織再生，肝功能得到改善，鑒于hiHeps在治療急性肝功能衰竭豬中的顯著療效，可通過細胞球懸浮技術(shù)開發(fā)下一代生物反應器用于急性肝功能衰竭患者[27]。

綜上所述，干細胞用于生物型人工肝治療肝衰竭的臨床療效顯著，同時具有肝臟細胞合成分泌白蛋白、分泌凝血因子、清除血氨的功能，促進肝細胞再生，但其仍處于臨床實驗階段。

四、討論與展望

研究報道[23, 27]，肝細胞樣細胞可來自HPSCs，因此HPSCs衍生的肝細胞可作為BAL細胞來源，但HPSCs真正用于BAL仍需要解決以下問題： 1、生產(chǎn)臨床使用的BAL裝置至少需要450億個HPSCs來源的肝細胞，而培養(yǎng)450億HPSCs并誘導其分化為肝細胞的過程消耗大量培養(yǎng)基和補充物，對于大規(guī)模的臨床應用來說成本過于昂貴。2、目前對HPSCs衍生的肝細胞是否可以在BAL裝置中長期維持其肝功能尚未研究充分，并且需要解決在整個治療過程中細胞活力和功能有可能喪失的問題。BAL仍處于臨床實驗階段，未來進入臨床造?；颊呷孕枰M一步研究。