宋紅波 楊淑娟 李燕平 賈小洲 王鳳蘭

慢性乙型肝炎中大概有25%～40%會演變成肝硬化，最終至肝癌。找到與疾病發(fā)病過程相關的生物標志物十分重要。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種分泌型、黏附性的鈣結合磷酸化糖蛋白，研究表明，OPN可能在乙肝肝硬化當中擔任一定的作用[1]。小分子熱休克蛋白25(SmallHeat Shock Proteins 25(sHSP 25))在細胞內的作用包括賦予細胞以耐熱性以抵抗高溫，防止蛋白聚集，抑制細胞凋亡，調節(jié)細胞生長[2]。sHSP25是上皮細胞受損后的重要修復因子，肝硬化患者胃腸道菌群失調，易誘發(fā)細菌性腹膜炎，那么在這部分患者體內，可能存在著sHSP25表達異常[3]。本研究對乙肝肝硬化患者血清OPN、sHSP25水平進行檢測，結合患者的肝臟指標和基礎生化指標，分析這兩種蛋白與疾病病程的關系。

資料與方法

一、一般資料

本研究采用前瞻性研究模式，選取2014年2月至2016年2月來我院進行治療的乙肝肝硬化患者作為研究對象，按照納入標準和排除標準選擇其中120例作為研究對象進行分組。將其根據(jù)Child-Pugh評分分為A、B、C三組：評分在5～6分之間的患者為A組(無肝硬化)；評分在7～9分之間的患者為B組(輕至中度肝硬化)；評分在10～15分之間的患者為C組(嚴重肝硬化)。選擇同一時間來我院進行體檢的健康人群作為對照組。其中，A組共32例患者，男17，女15，平均年齡(49.8±3.6)歲；B組共48例患者，男23，女25，平均年齡(46.7±5.4)歲；C組共40例患者，男28，女22，平均年齡(47.1±6.2)歲；對照組共40例患者，男18，女22，平均年齡(46.8±4.9)歲。

經(jīng)檢驗，四組患者基本情況差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲得了我院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有患者均對研究內容知情同意并簽署了知情同意書。

二、 納入標準和排除標準

(一)納入標準 1、患者有慢性乙型肝炎病毒感染病史，相關標準如下：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性，乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性或陰性，且乙型肝炎核心抗體IgM陰性；或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性，乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性或陰性，且肝組織活檢結果顯示感染慢性乙肝，在有肝組織活檢結果的情況下，以肝組織活檢結果為準；2、未接受過任何抗病毒治療者；或既往接受過干擾素或聚乙二醇干擾素治療，或接受過抗HBV核苷類藥物(拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋、阿德福韋酯或替諾福韋酯)治療者，終止治療時間距離篩選≥3個月；3、既往6個月未接受過中藥、免疫調節(jié)劑、胸腺肽或其他免疫刺激因子等抗病毒治療者；

(二)排除標準 1、有藥物濫用史或尿檢陽性(阿片類、巴比妥類、苯二氮卓類、三環(huán)抗抑郁藥、苯環(huán)己哌啶、安非他命、大麻、可卡因)者；2、過敏體質者(多種藥物及食物過敏)，包括已知對核苷或核苷類似物過敏；3、試驗前3個月內參加了任何臨床試驗(如果受試者在治療前退出研究，即未被隨機化或未接受治療，可以入組本研究)。

三、實驗方法

(一)樣本采集和分析 所有患者均禁食12 h后取靜脈血，離心，收集血清用于各項生理生化指標測定。本研究采用山東省西奈電子設備有限公司生產(chǎn)的B360全自動血液分析儀對實驗樣本進行檢測，測定所有血液樣本的總膽紅素(Total bilirubin, TBil)、清蛋白(Albumin, Alb)和凝血酶原時間(Prothrombin time, PT)，采用改良鱉試驗法測定血內毒素水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清OPN和sHSP25水平，酶聯(lián)免疫試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物科技有限公司，所有操作步驟均按照說明書所標明標準操作步驟來進行。

同時對患者的四項肝纖維化指標也進行檢測，包括透明質酸酶(Hyaluronidase，HA)，層黏連蛋白(Laminin，LN)，Ⅲ型前膠原氨基端肽(Type III procollagen amino terminal peptide，PIIINP)和Ⅳ型膠原(Type Ⅳ collagen, CIV)。檢測方法為放射免疫法。

結 果

一、臨床生化指標對比

四組受試者臨床生化指標：TB在對照組、A組、B組和C組患者體內的水平分別為13.26±2.16，28.43±9.24，48.24±10.25，148.3±14.16(μmol/L)；Alb：37.46±4.47，36.21±2.24，29.02±1.73，26.08±1.19(g/L)；PT: 13.87±2.75,14.75±3.19,17.78±2.83,21.89±0.90(s)；內毒素：0.05±0.01，0.07±0.02，0.13±0.06，0.34±0.11(Eu/mL)。對照組受試體內TB水平顯著低于其余三組(P<0.05)，而隨著乙肝患者Child-Pugh評分增加，其體內TB水平明顯增加(P>0.05)。A組患者的對照組受試者Alb、PT和內毒素水平?jīng)]有顯著差異，但是與B組和C組患者Alb、PT和內毒素水平有顯著差異。對照組和A組Alb水平顯著高于B組和C組患者(P<0.05)，而PT顯著短于B組和C組患者(P<0.05)，內毒素水平顯著低于B組和C組患者(P<0.05)。

二、肝纖維化指標對比

四組受試者肝纖維化指標結果：HA在對照組、A組、B組和C組患者體內的水平分別為：60.79±10.13，62.26±8.02，150.43±30.06，424.06±46.93(ng/mL)；LN：71.46±7.17，72.38±8.53，171.94±24.14，325±65.34(ng/mL)；PIIINP：64.27±11.04，66.04±9.01，190.12±30.03，246.45±45.70 (ng/mL)；CIV：52.41±6.15；51.87±8.09，100.26±15.17，180.68±30.13 (ng/mL)。對照組受試者和A組患者之間的四項肝纖維化指標沒有顯著差異(P>0.05)，但B組和C組患者四項肝纖維化指標水平顯著大于A組和對照組(P<0.05)，且C組患者四項肝纖維化水平最高(P<0.05)。

三、血清OPN和sHSP25水平

四組受試者血清OPN和sHSP25水平結果：OPN在對照組、A組、B組和C組患者體內的水平分別為：25.42±4.52，55.27±12.63，85.42±21.63，138.85±29.7(ng/mL)，sHSP25：89.43±12.45，109.94±15.56，183.09±25.54，207.06±32.49 (μg/L)。A、B、C三組患者OPN和sHSP25水平顯著高于對照組受試者，且隨著Child-Pugh評分的增高，乙肝患者體內OPN和sHSP25水平逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

討 論

從動態(tài)的觀點來看，肝硬化是肝纖維化的晚期和極端嚴重化的狀態(tài)[4]。肝纖維化和肝硬化的發(fā)生、發(fā)展和轉歸取決于二者的“凈效應”。OPN是細胞外基質中的一種非膠原糖蛋白，它可以通過一些生理途徑調節(jié)和影響細胞外基質的沉積。有研究表示[5]，OPN與其下游受體相結合后具有激活和促進肝星狀細胞增殖的生理作用。而肝星狀細胞則可以直接參與到細胞外基質的合成當中。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，隨著患者Child-Pugh評分的增加，肝纖維化指標的增大，乙肝患者體內的OPN水平也呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢。由此說明，OPN在乙肝患者肝纖維化和肝硬化的過程中起到重要作用，通過對OPN的檢測，可以輔助臨床對于乙肝患者肝臟生理功能的判斷。

除了高溫以外，其他一些刺激因素如氧自由基、缺氧、病毒入侵、細菌感染等，也會造成細胞分泌HSP[6]。乙肝肝硬化患者往往存在胃腸道菌群過度生長并通過小腸上皮細胞侵入體液，造成患者血液感染的例子[7]。在本研究，我們也對患者體內內毒素水平進行了監(jiān)測，結果發(fā)現(xiàn)隨著患者肝硬化程度的增加，其血液中內毒素水平也在逐步增加。受到胃腸道過度繁殖的菌群的刺激，乙肝肝硬化患者體內sHSP25的表達也顯著增加。胃腸道菌群繁殖時產(chǎn)生的鍛煉脂肪酸、脂多糖等可以刺激腸道上皮細胞生成sHSP25，是促使sHSP25分泌的生物物質基礎[8]。胃腸道上皮細胞過度分泌sHSP25是一種生理保護的反應，sHSP25具有修復胃腸道降低胃腸道通透性的生理作用。

綜上所述，乙肝肝纖維化患者血清OPN和sHSP25水平可以反應患者肝硬化程度，兩者水平越高的患者肝功能越差。