李秀偉，胡曉麗，施中凱，金 薇，姜月紅，馮恩航，蔣 蕊，劉惠敏，楊淑莉

(黑龍江省醫(yī)院：1.輸血科；2.感染科；3.實驗診斷部；4.財務科，黑龍江哈爾濱 150036)

輸注儲存紅細胞是一種經(jīng)驗性治療方法，至今仍然是緩解大量失血、嚴重貧血、骨髓抑制、紅細胞異常破壞患者的重要治療手段。近年來，有關輸血不良反應與離體紅細胞經(jīng)長期儲存產(chǎn)生“儲存損傷”，即紅細胞經(jīng)過體外長時間的低溫儲存后，紅細胞的代謝、形態(tài)結構、生理功能和生化指標等與體內(nèi)的紅細胞有很大的差異[1]的關系成為研究熱點?，F(xiàn)有研究已知，全血離開人體即發(fā)生變化，其損傷程度與保存液種類、溫度、時間等因素有關，如果溫度和保存液的種類不變，則儲存損傷的變化隨保存時間而增加；紅細胞懸液隨著貯存時間的延長，細胞內(nèi)的能量和三磷酸腺苷(ATP)消耗導致紅細胞形態(tài)發(fā)生變化，其膜結構的改變以及對陽離子主動轉運功能受阻，血紅蛋白(Hb)游離于細胞外[2]；同時，細胞內(nèi)一氧化氮(NO)及其衍生物含量迅速下降，隨后細胞生化代謝、功能及形態(tài)學相繼發(fā)生改變[3]。總之，紅細胞經(jīng)體外儲存發(fā)生溶血反應，回輸之后由于紅細胞生存率下降導致血管內(nèi)溶血，體內(nèi)游離血紅蛋白(FHb)含量顯著增加，對NO的清除作用增強[4]。

目前，國內(nèi)對此僅限于動物實驗或體外研究,如通過建立小鼠紅細胞體外儲存系統(tǒng),模擬臨床輸血，或用于測量庫血的FHb與NO指標，或向庫血中添加NO以觀察其對儲存損傷的改善程度等。本研究觀察患者輸血前后循環(huán)FHb水平、NO消耗、結合珠蛋白(HP)情況，旨在了解輸注庫存血對患者循環(huán)的影響，以期找到關聯(lián)因素，預防相關的輸血不良反應。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年7月至2015年6月在本院骨科、普外科、循環(huán)內(nèi)科、及血液科住院的患者中33例為備選對象。經(jīng)院級醫(yī)學倫理委員會同意，采用每位患者輸血前的檢驗用標本，以及輸血治療后24 h觀察輸血療效的檢驗用標本(醫(yī)生往往在輸血后24 h采集血液進行化驗，以獲知和評價輸血療效)，盡量減少患者的痛苦，其余時間點的標本采集必須征得患者及其家屬的同意，方可實施。輸血前的標本規(guī)定在輸血治療前1～3 d內(nèi)，臨床上已有輸注2 U紅細胞懸液的指征和意向，確認已簽署輸血治療知情同意書，然后項目組再跟進，做患者思想工作，同意其他時間點采集標本的請求，同時簽署黑龍江省醫(yī)院開展臨床研究、調(diào)查、試驗患者知情同意書。完全符合條件的方可成為本研究的受試對象，并由專業(yè)護士采取。備選對象中有1例外傷患者輸注8 U以上紅細胞懸液并因死亡退出、1例輸注4 U紅細胞懸液和1例輸注1 U紅細胞懸液者退出研究。最終有30例患者合格，年齡40～90歲，平均(60.2±15.69)歲，男22例，女8例。同時收集患者相關病史資料，如民族、年齡、性別、籍貫等保留資料。

1.2試驗分組 已有研究對結合珠蛋白生成障礙性貧血患者做了儲存紅細胞中NO的變化與輸注效果的研究；也有研究證實了血液腫瘤患者(急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、睪丸癌、髓系肉瘤、非霍奇金型B細胞淋巴瘤、骨髓增生異常淋巴瘤)的輸血增加FHb水平和NO的消耗[5]。因此，本研究擬對創(chuàng)傷患者、血管內(nèi)皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血患者進行研究。創(chuàng)傷組10例，包括外傷和骨折患者術中及病房輸血患者，排除慢性病、血液病、肝、腎功能損害者；內(nèi)皮損傷組10例，包括糖尿病、高血壓、高血脂、腦卒中、心力衰竭、上消化道出血患者；非珠蛋白生成障礙貧血病組10例，包括缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、骨髓抑制患者。

1.3儀器與試劑 酶標儀(PHOMO2010，鄭州安圖生物)及其配套的NO(批號201501)、HP(批號201501)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海江萊生物)；半自動生化分析儀(GF-D200，山東高密彩虹)及其測定血漿FHb(批號150619)試劑盒(北京瑞爾達生物科技有限公司)。

1.4檢測指標 輸血前1～3 d采集患者抗凝血3 mL/(人)份(EDTA-K2抗凝)和非抗凝血4 mL/(人)份以半自動生化分析儀檢測FHb，酶標儀檢測NO、HP水平，記錄檢測數(shù)據(jù)，給予2 U紅細胞懸液[紅細胞懸液均來自黑龍江省血液中心，輸血時距采集、制備和儲存時間是(21±3)d，之所以選擇這個天齡的紅細胞懸液，是因為想研究輸注一定天齡的紅細胞懸液對循環(huán)FHb和NO的影響]后，分別于輸血后15 min、1 h、2 h、24 h、1周等時間點采集每例患者與輸血前等量抗凝血和非抗凝血標本，重復檢測并相應記錄檢測數(shù)據(jù)。

2 結 果

2.1FHb水平：輸血前后有差別(F處理=11.72，P<0.01)；30名患者的FHb水平有差別(F配伍=21.89，P<0.01)；FHb測定：3組間無差別(F=0.43，P>0.05)，見表1。

2.2NO水平：輸血前后有差別(F處理=19.69，P<0.01)；30名患者的NO水平有差別(F配伍=11.967，P<0.01)；NO測定：3組間無差別(F=0.998，P>0.05)，見表2。

2.3HP水平：輸血前后有差別(F處理=7.25，P<0.01)；30名患者的HP水平有差別(F配伍=13.72，P<0.01)；HP測定：3組間無差別(F=0.744，P>0.05)，見表3。

表1 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后FHb變化比較

表2 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后NO變化比較

表3 3組不同疾病患者輸注儲存紅細胞前后HP變化比較情況

3 討 論

本研究數(shù)據(jù)證實，患者輸血是一個動態(tài)的變化過程，特別是儲存紅細胞重新被輸注進生命體后產(chǎn)生著一系列復雜的級聯(lián)反應。首先，紅細胞離開生命體被放入保存液中，經(jīng)過低溫儲存，如本組輸注的紅細胞儲存期為(21±3)d后，F(xiàn)Hb明顯增加，據(jù)報道儲存10～30 d的紅細胞血漿中的FHb逐漸增高，20 d已高于正常范圍(40 mg/L)[2]，而且約有25%的紅細胞在輸入患者體內(nèi)<24 h即被破壞，造成血管內(nèi)溶血[4]。這就是輸入儲存紅細胞15 min后受血患者體內(nèi)的FHb明顯增加的原因。

哺乳動物體內(nèi)NO主要由一氧化氮合酶(NOS)以左旋精氨酸(L-Arg)為底物而合成[6]；根據(jù)NO的來源不同，NOS分為：(1)內(nèi)皮型NOS(eNOS)，存在于血管內(nèi)皮、支氣管內(nèi)皮和海馬錐體細胞層；(2)神經(jīng)型NOS(nNOS),存在于視網(wǎng)膜、植物神經(jīng)纖維、大腦皮層、骨骼肌細胞和平滑肌細胞等；(3)誘導型NOS(iNOS)，存在于肝細胞、單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞。eNOS與nNOS正常狀態(tài)下即可表達，需鈣離子參與，iNOS在多數(shù)情況下只在免疫應答和神經(jīng)損傷后才表達，非鈣離子依賴性[2]。還有一種非酶生性NO，通過供體生成。本研究數(shù)據(jù)顯示，3組(不同疾病)患者輸血后15 min，其體內(nèi)血漿中NO有1個短暫性提高?？赡苁怯捎跈C體因輸血對異種基因抗原進入體內(nèi)，產(chǎn)生的一種免疫應答[7]，存在于巨噬細胞內(nèi)的iNOS在機體免疫應答時出現(xiàn)表達合成NO所致[2]。

Hb對NO有很強的清除能力。氧合Hb(oxyHb)和NO反應生成硝酸鹽和高鐵Hb(metHb),從而大大降低血管內(nèi)皮NO的生物利用率。正常情況下，Hb被包裹在紅細胞內(nèi)，在紅細胞膜的屏障作用下，膜外的非擾動層和血液層流狀態(tài)造成與內(nèi)皮細胞間的無細胞區(qū)，NO不被Hb清除；FHb與NO的反應速率是紅細胞內(nèi)Hb的500～1 000倍[4]。FHb增加后，NO的生物利用率大大降低，這也許就是受血者在輸血后1 h至1周NO大幅下降的原因。

本研究中3組患者的HP水平在輸血后15 min也有1個短暫性的升高，因為HP主要在肝臟合成，是一種急性期時相反應蛋白，當機體處在應激狀態(tài)時，血液中的HP明顯增多，如機體處于心肌梗死、腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷、感染等病理狀態(tài)時，以及應用某些激素，如皮質(zhì)激素和雄性激素后，其血清HP水平常有顯著提高，可用于鑒別急性、亞急性與慢性病理狀態(tài)，在一定程度上與病理損傷的性質(zhì)和范圍也有相關[6-7]。HP的主要功能是結合FHb，形成穩(wěn)定的HP-Hb復合物，這種結合使HP和Hb的構型和特征均發(fā)生改變。HP-Hb的功能既不同于HP，亦不同于Hb，且這個反應基本上是不可逆的。HP的降解也在肝臟，血漿中的HP 與FHb結合后大部分被輸送至肝臟分解。臨床上有許多病因可造成紅細胞破壞，如創(chuàng)傷、燒傷等，致血液中FHb明顯升高，而HP與FHb結合后形成的復合物可被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞迅速清除，但該復合物因分子量大，不能通過腎小球濾膜而經(jīng)尿液排出,故可阻止亞鐵血紅素的漏失,且可防止溶血導致的腎臟受損[8]。最近有研究顯示，Hb與HP一旦結合，即迅速在2個場所肝細胞(90%)和單核細胞/巨噬細胞(10%)之一從血液被清除。對于HP-Hb復合物在肝細胞上的特異性受體尚未被發(fā)現(xiàn)，但單核細胞/巨噬細胞上的受體，最近已證實為CD163[9]。CD163(HbSR)是一種迄今為止僅僅在單核-巨噬細胞系統(tǒng)細胞膜上發(fā)現(xiàn)的跨膜分子，屬于富含半胱氨酸的清道夫受體超家族的成員之一。它可以特異性地識別Hb-HP復合體[10]。

當血漿中增高的FHb超過HP的結合能力時，剩余的FHb與血漿中的血結素結合,小部分轉變?yōu)楦哞F血紅蛋白，與血漿中清蛋白結合形成高鐵血紅素清蛋白；大部分通過腎臟排泄，形成血紅蛋白尿[2]。已經(jīng)有研究者對HP生成障礙性貧血患者做了儲存紅細胞中NO的變化與輸注效果的研究，證明隨著紅細胞貯存期延長，NO水平有持續(xù)下降的趨勢(P<0.01)，紅細胞輸注效率(輸注紅細胞24 h復查Hb，并與輸血前比較，達到預期值是為有效)也隨之下降(P<0.01)[11]。本研究中選定一組非結合珠蛋白生成障礙性貧血患者，在輸注2 U紅細胞懸液15 min后HP有一個大幅度提高,是因為HP應激狀態(tài)導致生成增多，當發(fā)揮其清道夫功能后，結合FHb后逐漸減少，最后低于輸血前水平；FHb被消耗后，又制約了NO的持續(xù)減少。

本研究3組患者(創(chuàng)傷、血管內(nèi)皮損傷患者和非珠蛋白生成障礙性貧血病)FHb、NO和HP水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。輸注儲存紅細胞并不一定因其中FHb增加便影響了NO的利用率而出現(xiàn)輸血患者血漿中NO的持續(xù)減少，原因可能在于輸注儲存紅細胞后機體產(chǎn)生一系列的反應，這個過程是在FHb與NO反應、而HP又與FHb反應的互相制約最后達到消長平衡的變化中完成的。