高 明，楊曉英，毛曉莉△

(1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院輸血科，上海 201499；2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院輸血科，上海 201499)

類風濕關節(jié)炎急性階段(ASRA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病，ASRA的發(fā)病可能與遺傳、感染、性激素等有關。一旦發(fā)病，隨著病情的發(fā)展進程而逐漸影響患者的生活質量，所以早期診斷、無創(chuàng)診斷，有利于縮短病程，大大改善患者預后[1-5]。抗β2糖蛋白Ⅰ抗體是抗磷脂抗體的主要組成部分，是溝通免疫與凝血兩大系統(tǒng)的重要橋梁，在ASRA患者中會出現(xiàn)一定程度的升高[6]。膜糖蛋白GPⅠb是血小板發(fā)生病變的敏感指標，研究發(fā)現(xiàn)在ASRA患者中具有一定的診斷價值[7]?？规溓蚓苎豋是A組鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，可以溶解人紅細胞，具有很強的抗原性，在ASRA患者的血清中通常檢測到抗鏈球菌溶血素O值的升高[8]。以上指標在臨床檢測中廣泛開展，但對ASRA的診斷價值未知，本研究采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析相關指標的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院收治的67例ASRA患者為病例組，其中男25例，女42例，平均(33.84±9.50)歲。選取院內體檢健康者50例為對照組，其中男23例，女27例，平均(34.60±5.70)歲，ASRA患者按照《類風濕關節(jié)炎急性階段診斷標準》篩選入組。本研究獲上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1膜糖蛋白GPⅠb檢測 病例組和對照組均收集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)7.2 mg抗凝血4.0 mL,1 500 r/min離心5 min，分離上層的富血小板血漿，加1%甲醛(PMA)室溫固定，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)將血小板的濃度調整至(2.5～3.5)×107/L。50 μL CD42b-FITC (Becton Dickinson公司)與100 μL血小板溶液振蕩混勻，避光常溫孵育30 min，加2 mL 1×溶血素,室溫反應15 min,1 500 r/min離心5 min。棄上清,以2 mL PBS洗滌2遍,最后以1%的甲醛固定30 min,上機獲取細胞10 000個檢測。上機測試分析,Beckman EPICSX型流式細胞儀上測定熒光平均熒光強度(Sample FL1 Median)的陽性百分標記率,記錄結果。

1.2.2抗β2糖蛋白Ⅰ抗體檢測 病例組和對照組均收集無添加劑全血5.0 mL,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法檢測待測樣本血清中抗β2糖蛋白Ⅰ抗體水平，3 000 r/min離心15 min。取血清100 μL加入至特異度抗原包被的微孔反應板中，37 ℃孵育60 min，洗板、拍板，加入50 μL(1滴左右)酶結合物，充分混勻，封板，37 ℃孵育30 min，再次洗板、拍板，加入顯色液A、B各50 μL(1滴左右)，充分混勻，封板，37 ℃孵育15 min，加入50 μL(1滴左右)終止液，混勻。用酶標儀讀數(shù)(波長450 nm)，空白對照孔校零，讀取各孔吸光度(A)值。

1.3抗鏈球菌溶血素O檢測 病例組和對照組均收集無添加劑全血5.0 mL,采用免疫比濁法檢測待測樣本血清中抗鏈球菌溶血素O水平，樣本離心后，在全自動生化分析儀上進行檢測，測定波長為540 nm，讀取A值，對照標準曲線得出結果。

2 結 果

2.1病例組與對照組抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O的表達水平分析 兩組抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O水平差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.000、0.000)，見圖1、2和表1。

圖1 膜糖蛋白GPⅠb低表達流式熒光圖

2.2病例組各項指標與疾病的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O與ASRA呈正相關。見表2。

圖2 膜糖蛋白GPⅠb高表達流式熒光圖

表1 病例組和對照組抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖、蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O水平的比較

組別n抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(RU/mL)膜糖蛋白GPⅠb(%)抗鏈球菌溶血素O(IU/mL)病例組6723.97±7.11?14.19±6.81?76.78±32.04?對照組5015.98±6.015.12±3.7922.68±17.29

注：與對照組比較，*P<0.01

表2 抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O與ASRA的相關性分析

2.3抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O對ASRA的診斷價值 ROC曲線分析顯示，抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O判斷ASRA的靈敏度和特異度較好(均P=0.00)。β2糖蛋白Ⅰ抗體對ASRA的最佳診斷界值為21.84 RU/mL，此時的靈敏度為0.746,特異度為0.920，約登指數(shù)為0.666，kappa值為0.645。膜糖蛋白GPⅠb對ASRA的最佳診斷界值為14.79%，此時的靈敏度為0.672，特異度為0.940，約登指數(shù)為0.612，kappa值為0.584?？规溓蚓苎豋對ASRA的最佳診斷界值為51.32 IU/mL，此時的靈敏度為0.836,特異度為0.940，約登指數(shù)為0.776，kappa值為0.761。見表3、圖3。

表3 抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O與ASRA的ROC曲線下面積分析

圖3 抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O單項檢測診斷ASRA的ROC曲線

3 討 論

抗β2糖蛋白Ⅰ抗體是病理狀態(tài)下抗磷脂抗體分布到細胞膜外，當抗磷脂抗體與血清中的β2糖蛋白Ⅰ型結合后即暴露出抗原位點，從而誘導產(chǎn)生的一類自身抗體[9]。對抗磷脂抗體綜合征(其靈敏度30%～60%，特異度98%)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有一定的診斷價值，在ASRA患者中可見升高，但具體診斷價值筆者查閱文獻未見詳細報道[6,10]。已有研究表明,ASRA發(fā)病機制可能是由于凝血系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)共同作用導致的，前期篩查發(fā)現(xiàn)血小板膜糖蛋白GPⅠb在ASRA患者中有一定程度的升高[7,11-12]。同時，研究表明,類風濕關節(jié)炎的發(fā)病可能與某些微生物的感染有關，感染后引起異常免疫反應，鏈球菌也可能混雜在其間，部分參與了感染，因而出現(xiàn)了抗鏈球菌溶血素O， 類風濕關節(jié)炎患者抵抗力較差，容易受到鏈球菌的侵襲，在臨床上常見到類風濕關節(jié)炎患者伴隨有鏈球菌感染[13-17]。目前主要應用于臨床的抗鏈球菌溶血素O診斷效能并不能完全滿足臨床需求，存在一定的診斷盲區(qū)，故本研究嘗試將抗β2糖蛋白1抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O聯(lián)合研究，以探討其在ASRA中的診斷價值，提高其診斷效能。

本研究結果顯示，ASRA病例組的抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，認為抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O可以作為診斷ASRA的潛在指標。進一步相關性分析顯示，抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O與ASRA呈正相關，故抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O具有診斷ASRA的效能。采用ROC曲線分析得出抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O各檢測指標的詳細診斷性能，其中抗鏈球菌溶血素O的診斷效能最為突出。

4 結 論

綜上所述，抗β2糖蛋白Ⅰ抗體、膜糖蛋白GPⅠb、抗鏈球菌溶血素O是ASRA診斷的良好指標，有助于ASRA的早期診斷，為臨床及早對病情進行干預、監(jiān)測提供有價值的信息。但是已有研究報道抗鏈球菌溶血素O并不能像紅細胞沉降率、C-反應蛋白一樣作為判斷病情嚴重程度和衡量治療效果的指標[16-17]。因此，在類風濕關節(jié)炎的檢查中不宜單獨使用抗鏈球菌溶血素O判斷類風濕關節(jié)炎病情的發(fā)展，抗鏈球菌溶血素O僅限于在ASRA中或與其他檢測指標聯(lián)合診斷評估病情。