王森業(yè)，殷博迪，王玉寧，陳勝昔，錢慧琴，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，河南新鄉(xiāng)453000；2.河南師范大學，河南新鄉(xiāng)453000）

地榆為薔薇科地榆屬植物地榆（Sanguisorba officinalis）或長葉地榆 （Sanguisorba officinalis var.longifolia）的干燥根，具有涼血止血、解毒斂瘡的作用[1]?，F代醫(yī)學研究表明，地榆具有止血[2]、抗腫瘤[3]、抗過敏[4]、抗炎[5]、改變血液系統(tǒng)[6]、抗氧化[7-8]等作用。地榆主要含有鞣質類、三萜皂苷類、黃酮類和酚酸類等化學成分[9]。目前，國內對地榆多酚和總黃酮抗氧化能力已有文獻報道[7-8]，而地榆總三萜的抗氧化活性未見報道，而天然產物抗氧化能力與活性成分含量有關，因此，研究不同提取方法對地榆總三萜的含量的影響及其提取物的抗氧化活性是很有必要。目前，提取總三萜的方法較多，張爽、林水花等[11-12]利用超聲提取法取得一定成果。本研究采用水煮醇沉法、浸漬法和回流提取法[10]比較地榆總三萜的提取工藝，以熊果酸為對照，紫外分光光度法測定地榆總三萜含量，確定其最佳提取方法，并對地榆總三萜提取物抗氧化活性能力進行評價，為地榆三萜類化合物的提取和抗氧化活性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地榆：于2017年8月采自河南省新鄉(xiāng)市萬仙山國家森林公園，經新鄉(xiāng)醫(yī)學院教授閆福林鑒定為薔薇科地榆屬植物地榆。熊果酸（批號110742-201622）：中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（CAS：1898-66-4）：東京化成工業(yè)株式會社；VC（J07N7R24305）：源葉生物科技有限公司；高氯酸、香草醛、冰乙酸、甲醇、無水乙醇：均為分析純，天津市德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHZ-3型循環(huán)水式真空泵：鄭州杜甫儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

新鮮地榆的根洗凈，用濾紙吸干，于60℃烘干，粉碎，過篩（60目），將烘干樣品放入廣口瓶，置于-20℃冰箱保存，備用。

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 水煮醇沉法

精密稱取地榆根粉末 5.0 g，分別按 1 ∶10、1 ∶8、1 ∶6（g/mL）的料液比加水溶液，煎煮3次，分別煮沸2、1、1 h，合并 3次濾液，濃縮至 1∶1（1 g生藥相當1 mL），然后加入2倍體積95%乙醇沉淀，放置24 h，過濾，濾液濃縮干燥得總提取物，轉移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.2 回流提取法

精密稱取地榆根粉末5.0 g，按1∶10（g/mL）的料液比加60%乙醇溶液加熱回流提取，提取3次，每次2 h，合并3次濾液，濃縮干燥得總提取物，轉移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.3 浸漬法

精密稱取地榆根粉末5.0 g，按1∶10（g/mL）的料液比加60%乙醇溶液室溫下浸提5 d，浸提3次，濾過，濾液濃縮干燥稱量得總提取物，轉移至50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.3 不同提取方法中地榆總三萜含量測定

1.3.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的熊果酸對照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，定容，搖勻即得濃度為0.10 mg/mL的熊果酸對照品溶液。精密吸取熊果酸對照品溶液 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL置于試管中，水浴蒸干無水乙醇，加0.2 mL香草醛-冰乙酸溶液和1.0 mL高氯酸，在60℃水浴加熱15 min后，移入冰水浴中，再加入5.0mL冰乙酸，搖勻，在545 nm處測定吸光度值。以熊果酸濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標進行線性回歸。

1.3.3.2 精密度試驗

精密移取6份熊果酸對照品溶液0.2 mL于試管中，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗

取“1.3.2.2”項下樣品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密移取6份0.2 mL上述溶液，分別于 0、25、50、75、100、125 min 按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.4 重復性試驗

取“1.3.2.2”項下樣品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密移取6份0.2 mL上述溶液，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.5 加樣回收率試驗

分別取乙醇回流法供試品溶液6份0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再分別精密移取6份1.0 mL上述溶液，加入對照品0.1 mL，按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），計算平均值及RSD值。

1.3.3.6 地榆總三萜含量測定

分別精密吸取水煮醇沉法、乙醇回流法、浸漬法供試品溶液0.2 mL，定容于10 mL容量瓶中，得樣品稀釋液，再精密吸取樣品稀釋液0.2 mL按“1.3.3.1”項下方法測定吸光度值（A），按回歸方程式計算出不同提取方法所得提取物的總三萜含量。

1.3.4 地榆總三萜抗氧化活性測定

1.3.4.1 DPPH溶液的配制

參照曾智等[13-14]的方法加以修改后，精密稱取13.0 mg的DPPH粉末到250 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，搖勻，制得濃度為0.13 mmol/L的DPPH溶液，備用。

1.3.4.2 VC樣品溶液的配制

精確稱定VC10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，無水乙醇定容，配制成VC濃度為0.56 mmol/L的儲備液。再分別稀釋成 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、20.0、22.0 μg/mL VC的一系列溶液。

2.4.3 地榆中總三萜對DPPH自由基清除活性的測定

將“1.3.2.2”項下地榆總三萜配成濃度為0.28、0.67、0.84、1.00、1.12、2.80、5.60、8.40、14.00、16.80、22.40 μg/mL的一系列溶液，取上述樣品溶液2.0 mL，再分別加入DPPH溶液2.0 mL混勻，密封，避光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光度（A1），同時以等量乙醇溶液作為空白對照，測定吸光度值A2（即為2 mL的0.13 mmol/L DPPH溶液加入2.0 mL的無水乙醇溶液），測定2 mL的無水乙醇溶液和2 mL不同質量濃度的樣品液混合液的吸光度為A0。根據下面的公式計算清除率及IC50。

式中：A2為2 mL DPPH溶液中加入2 mL的無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH溶液中加入2 mL不同質量濃度樣品溶液的吸光度；A0為2 mL無水乙醇中加入2 mL不同質量濃度樣品液的吸光度。

1.4 數據統(tǒng)計對比分析

采用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計以及圖標的建立；半數清除率IC50采用SPSS 22.0軟件計算。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以熊果酸濃度為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，制定熊果酸溶液標準曲線見圖1，得線性回歸方程y=0.008 3x-0.065 8，相關系數 R2=0.999 1（n=8），在30 μg/mL～100 μg/mL 范圍內有良好的線性關系。

圖1 熊果酸溶液標準曲線圖Fig.1 Standard curve of ursolic acid solution

2.2 精密度試驗

熊果酸標準品溶液精密度試驗結果見表1，計算RSD值為1.4%（n=6），表明該試驗精密度良好。

表1 精密度試驗結果Table 1 The results of precision density experimental

2.3 穩(wěn)定性試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的穩(wěn)定性試驗結果見表2，計算RSD值為0.81%（n=6），表明該樣品顯色后的吸光度值在125 min內顯色穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結果Table 2 The results of the stability experimental

2.4 重復性試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的重復性試驗結果見表3，計算RSD值為0.87%（n=6），表明該試驗重復性良好。

表3 重復性試驗結果Table 3 The results of repeated experimental

2.5 加樣回收率試驗

地榆回流提取法所制得的樣品溶液的加樣回收率試驗結果見表4，計算平均加樣回收率為93.85%，RSD值為1.7%（n=6），表明該試驗加樣回收率較好。

2.6 地榆總三萜含量測定

水煮醇沉法、回流提取法、浸漬法所得地榆總三萜含量為（44.31±0.82）、（88.66±1.70）、（55.26±0.21）mg/g，（n=3）?；亓魈崛》ㄋ玫赜芸側坪棵黠@高于水煮醇沉法和浸漬法。地榆總三萜含量測定結果見表5。

表4 加樣回收率試驗結果Table 4 The results of sample recovery experimental

表5 總三萜含量測定結果Table 5 The results of total triterpenoids content determination

2.7 DPPH自由基清除作用的測定

不同質量濃度的地榆總三萜、對照品VC溶液對DPPH自由基清除率結果見圖2。

圖2 地榆總三萜和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of total triterpenoids and ascorbic acid on DPPH radical

在濃度 1 μg/mL～ 10.0 μg/mL 范圍內，樣品清除能力隨總三萜濃度的升高而增強，當樣品濃度為5.60 μg/mL時其清除率達91.00%，但隨著濃度的增加，清除率增加不明顯，并趨于平衡。相同條件下，VC濃度為6.00 μg/mL時，其清除率為52.20%。根據SPSS 22.0軟件數據分析，地榆總三萜的IC50為3.04μg/mL，對照品VC的IC50為5.46μg/mL，結果表明，地榆總三萜清除DPPH自由基的能力優(yōu)于對照品VC，具有很強的抗氧化活性。

3 結論

本試驗采用回流提取法、冷浸法、水煮醇沉法提取地榆總三萜，3種提取方法所得提取物總三萜含量大小依次為：回流提取法（88.66 mg/g）＞浸漬法（55.26 mg/g）＞水煮醇沉法（44.31 mg/g）?；亓魈崛》ㄋ玫赜芸側坪孔罡?，可能是因為三萜易溶于乙醇，乙醇能與藥材充分接觸，同時加熱也使得總三萜溶解度增大，從而導致提取效率增加；若稍加改造其方法如增加回流時間等，提取率將會提高；也可能與操作步驟有關，回流提取法步驟簡單，減少在轉移過程中的損失；而水煮醇沉法操作復雜，雜質較多，可能含有糖類、蛋白質、色素等雜質，難以去除。綜合考慮，乙醇回流提取法提取地榆總三萜效果最佳，簡單易行，便于實現。

對最佳提取方法下提取得到的地榆總三萜進行體外抗氧化活性評價，其對DPPH自由基的半數清除率IC50值為3.04 μg/mL；對照品VC對DPPH自由基的半數清除率IC50值為5.46 μg/mL，表明地榆總三萜的抗氧化活性優(yōu)于VC，且隨著地榆總三萜濃度的增加抗氧化活性會隨之增強，這可能是與三萜化合物及其衍生物協(xié)同作用的結果?？寡趸钚苑治霰砻?，地榆總三萜具有較強的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，為開發(fā)利用地榆資源提供一定參考。