（吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130052）

黑豆（Glycine max），別名烏豆、冬豆子，為豆科植被大豆的黑色種子[1]，東北地區(qū)產(chǎn)量最大，其適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐瘠、耐鹽堿[2]。黑豆中不僅微量元素含量高，而且蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維的含量也很豐富[3]。黑豆中的花青素是很好的抗氧化劑來源，具有養(yǎng)顏美容，增加胃腸蠕動(dòng)的功能[4]。

花青素主要是多酚類物質(zhì)，是由黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二酚的配位縮合或聚合而成的低聚或多聚物，可以有效清除人體內(nèi)產(chǎn)生的活潑自由基[5-7]；花青素具有抗氧化、防治心血管疾病、抗癌、抗高血壓、降血糖等生物活性[8-11]，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好天然抗氧化劑之一[12-15]。

花青素在化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，可強(qiáng)化動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管，有效清淤化腫[16-18]，加快毛細(xì)血管血液流動(dòng)速度，減少毛細(xì)血管阻力，改善血管滲透性，從而提高組織細(xì)胞新陳代謝過程，使組織器官吸收養(yǎng)分和排除廢棄物更加自由[19]；花青素作為一種天然食用色素，安全無毒，不僅抗氧化活性強(qiáng)，而且在水和醇溶液中的溶解性也很好。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于黑豆花青素中的功效成分方面研究較少，黑豆的價(jià)值沒有充分發(fā)揮出來。因此該論文以黑豆為原料，響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆花青素提取工藝并評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為黑豆資源的開發(fā)與利用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑豆：吉林省長(zhǎng)春市歐亞超市，經(jīng)150℃烘焙熟制后，用高速粉碎機(jī)粉碎1次～2次，過60目篩備用。

1.2 試劑

無水乙醇、醋酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、1，1-二苯基苦基苯肼、鄰二氮菲、甲醇、香草醛：均為分析純。

1.3 儀器

UV-2102C型紫外可見光分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4型數(shù)顯控溫水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；CS-700Y型多功能粉碎機(jī)：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；ZD-2自動(dòng)電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-DⅢ循環(huán)水真空抽氣泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司；R-404A超低溫冰箱：賽默飛世爾科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定

用乙醇將黑豆花青素溶液定容至500 mL，取1 mL花青素原液于試管中，加入2.5 mL 30%硫酸試劑和2.5mL1%的香草醛溶液，搖勻后避光30min，于400nm～600 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描見圖1[20]。

圖1 黑豆花青素的可見光譜圖Fig.1 Visible spectrum disgram of anthocyanin on black bean

1.4.2 黑豆花青素含量的測(cè)定

試驗(yàn)采取pH差示法測(cè)定花青素得率[21]，計(jì)算公式如下：

其中：A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；MW 為矢車菊素-3-葡萄糖苷（449.2 g/mol）的分子量；DF為稀釋因子；ε為摩爾吸光系數(shù)[26 900 L/（mol·cm）]；L為光長(zhǎng)度（1 cm）。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆花青素提取工藝條件-Box-Behnken設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以影響黑豆花青素得率的主要因素，即提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度為輸入變量，花青素得率為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表Tabel 1 The factors and levels of response surface methodology

1.4.4 黑豆花青素的體外抗氧化能力測(cè)定

將最優(yōu)工藝條件下提取的花青素溶液真空濃縮、冷凍干燥，測(cè)定其體外抗氧化活性，包括對(duì)DPPH自由基的清除作用，參照林海楨等[22]的測(cè)定方法；對(duì)羥自由基的清除作用，參照范艷麗等[23]的試驗(yàn)方法；對(duì)金屬離子螯合劑的清除作用，參照邢穎等[24]的測(cè)定方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黑豆花青素得率的影響

乙醇濃度對(duì)黑豆花青素得率的影響，見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on anthocyanin yield

由圖2可見，隨著乙醇濃度的升高，黑豆花青素的含量逐漸增加，乙醇濃度達(dá)到70%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，黑豆花青素得率達(dá)到最大1.141 mg/g，此后乙醇濃度升高，黑豆花青素得率卻呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

2.1.2 提取溫度對(duì)黑豆花青素得率的影響

提取溫度對(duì)黑豆花青素得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield

由圖3可見，隨著提取溫度的升高，黑豆花青素得率先增加后減少，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，黑豆花青素得率達(dá)到最大0.982 mg/g。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑豆花青素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)黑豆花青素得率的影響，見圖4。由圖4可見，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑豆花青素得率先增加后減少，提取時(shí)間為3 h時(shí)，黑豆花青素得率達(dá)到最大0.949 mg/g。

圖4 提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on anthocyanin yield

2.1.4 pH值對(duì)黑豆花青素得率的影響

pH值對(duì)黑豆花青素得率的影響見圖5。

圖5 pH值對(duì)花青素得率的影響Fig.5 Effect of pH value on anthocyanin yield

由圖5可見，花青素得率的變化趨勢(shì)緩慢，說明pH值的變化對(duì)黑豆花青素得率的影響較小，所以在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中未考慮pH值的影響。

2.1.5 料液比對(duì)黑豆花青素得率的影響

料液比對(duì)黑豆花青素得率的影響，見圖6。

圖6 料液比對(duì)花青素得率的影響Fig.6 The effects of ratio of liquid to solid on anthocyanin yield

由圖6可見，隨著溶劑的增大，黑豆花青素得率先增加后減少，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，花青素的得率最大為1.081 mg/g。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

運(yùn)用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析，建立各影響因素之間的數(shù)學(xué)模型，并獲得黑豆花青素提取工藝的最優(yōu)條件，試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of tests

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及檢驗(yàn)

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3，回歸模型方程為：Y=-13.701+0.204X1+0.213X2+0.144X3+0.223X4+0.001X1X2+0.005X1X3-0.001X1X4+0.002X2X3-0.001X2X4+0.006X3X4-0.002X12-0.002X22-0.110X32-0.007X42。

由表3可知，失擬項(xiàng)（p=0.25）不顯著；模型組（p＜0.000 1）極顯著；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.960 7；回歸方程的C.V.值=5.19%（＜10%），說明試驗(yàn)所受外界因素影響較小。綜合分析表明用此模型來分析和預(yù)測(cè)黑豆花青素提取工藝結(jié)果比較合適。

表3 回歸模型分析Table 3 The analysis of variance for regression model

一次項(xiàng) X1、X2和二次項(xiàng) X12、X22、X32、X42的差異性極其顯著；一次項(xiàng) X3、X4和交互項(xiàng) X1X2、X1X3、X2X4差異顯著；單因素的主次影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比。

2.2.3 最優(yōu)工藝條件求取與驗(yàn)證

經(jīng)過響應(yīng)面軟件最終確定黑豆花青素最優(yōu)提取工藝，采用乙醇濃度63.97%，提取溫度60.83℃，提取時(shí)間3.17 h和料液比1∶14.15（g/mL）的條件下獲得的花青素得率為1.069 mg/g。由于考慮到試驗(yàn)條件和儀器等局限性和驗(yàn)證此結(jié)果是否可靠，通過修改工藝條件得到黑豆花青素最佳提取工藝為：乙醇濃度60%，提取溫度 60℃，提取時(shí)間 3 h，料液比 1 ∶15（g/mL），在此基礎(chǔ)上反復(fù)提取黑豆花青素5次并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得到的黑豆花青素的得率為（1.101±0.101）mg/g，接近理論預(yù)測(cè)值。

2.3 黑豆花青素體外抗氧化活性的研究

花青素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和鐵離子螯合劑的清除作用見圖7。

圖7 花青素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和鐵離子螯合劑的清除作用Fig.7 Scavenging effect of anthocyanin on DPPH radicals，hydroxyl radicals and Iron ion chelating agent

由圖7可見，DPPH自由基、羥自由基和鐵離子螯合劑清除率都隨花青素濃度的升高而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。當(dāng)花青素濃度為50 μg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除能力出現(xiàn)最大值84.32%，其清除率強(qiáng)于李子皮花青素（8 000 μg/mL時(shí)清除率為82.3%）[25]；當(dāng)花青素濃度為50 μg/mL時(shí)，羥自由基清除能力出現(xiàn)了最大值84.82%，其清除率強(qiáng)于海南蒲桃果花青素（80 μg/mL時(shí)清除率為75%）[26]；當(dāng)花青素濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)鐵離子螯合能力的最大值為93.09%，其鐵離子螯合能力強(qiáng)于紫薯花青素（100 μg/mL時(shí)鐵離子螯合能力為80%）[27]。

3 結(jié)論

該文采用溶劑回流法提取黑豆花青素，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到黑豆花青素最佳提取工藝為：乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時(shí)間 3 h，料液比 1 ∶15（g/mL），黑豆花青素得率可達(dá)（1.101±0.101）mg/g。體外抗氧化研究說明黑豆花青素對(duì)DPPH自由基、羥自由基對(duì)鐵離子具有較強(qiáng)的螯合能力，且劑量效應(yīng)關(guān)系十分明顯。黑豆花青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，關(guān)于黑豆花青素的體內(nèi)抗氧化活性及機(jī)理的研究將在后續(xù)課題中進(jìn)行探討。