張東峰，陳家豪，郭靜，陳海檳，李平凡

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院食品與生物工程系，廣東廣州510300；2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004；3.廣州市粵豪水產(chǎn)品檢測有限公司，廣東廣州510370）

我國是柑橘的主要產(chǎn)地之一，柑橘品種豐富。柑橘不僅具有營養(yǎng)價值更具有重要的醫(yī)學價值[1]。流行病學研究表明柑橘果實中富含的酚類物質(zhì)與其抗氧化活性密不可分[2]。酚類化合物是芳烴的含羥基衍生物，主要由三大類組成：生物類黃酮、單寧和酚酸。酚類物質(zhì)是植物中含量最多的次生代謝產(chǎn)物，其具有很強的抗氧化活性，有清除體內(nèi)自由基的作用[4-7]；還有抗癌、抗菌、抗炎、預防動脈粥樣硬化等積極作用，不僅對紫外線輻射效果顯著，還對多種疾病的發(fā)生有抑制作用[8]。從柑橘中鑒定出來的黃酮類化合物有很多種，如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等二氫黃酮類物質(zhì)；黃酮類化合物的作用有抗炎癥、強化血管、抗腫皰和抑制凝血等。不僅能降低膽固醇、防癌抗癌、分解脂肪、減少有色金屬和放射元素在人體內(nèi)的積累，還可以作為一種天然的風味改良劑、色素等[3]。類黃酮作為柑橘屬類植物中的一類重要活性物質(zhì)，分布在柑橘的各個部位中，一般來說，柑橘皮中最多[9-11]。柑橘中抗氧化的物質(zhì)主要有生物類黃酮、維生素E、維生素C等。而柑橘皮可廣泛用作精油提取[12]、飼料加工等原料[13]。

本研究選取7種柑橘，對柑橘果肉及果皮中多酚、黃酮等抗氧化活性成分進行測定，結(jié)合DPPH·、鐵還原抗氧化能力（ferricreducingantioxidantpower，F(xiàn)RAP）、ABTS+·等3種體外抗氧化方法，對7種柑橘果皮和果肉的抗氧化活性成分含量及抗氧化活性進行綜合比較分析，同時對柑橘的活性成分及抗氧化能力進行相關(guān)性分析、主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，探究不同種類柑橘皮的抗氧化活性成分及抗氧化能力大小，為柑橘特別是柑橘皮的加工利用提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦紅冰糖橙、錦蜜冰糖橙、紐荷爾臍橙、塔羅科血橙、椪柑、巴西柚：湖南麻陽某水果公司；崀山臍橙：湖南邵陽；福林酚：上海源葉生物技術(shù)有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪 （2，4，6-three pyridyl three-triazine，TPTZ）：都萊生物技術(shù)有限公司；水溶性維生素E（water-miscible vitamin E，Trolox）：華藍化學有限公司；2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：合肥博美生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazy，DPPH）：日本TCI公司；亞硝酸鈉：天津市大茂化學試劑廠；三氯化鋁、兒茶素、磷酸、濃鹽酸、乙醇、甲醇、冰醋酸、三氯化鐵、過硫酸鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1800紫外可見分光光度計：日本島津有限公司；JY92-III超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；JP-150A-8高速多功能粉碎機：永康久品工貿(mào)有限公司；AuY220電子分析天平：島津（香港）有限公司；MJ-25BM03C攪拌機：廣東美的精品電器制造有限公司；101-2AB電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

柑橘果肉樣品的制備：新鮮柑橘去皮，將果肉榨汁，抽濾后取上清液。柑橘皮粉末樣品的制備：手動剝橘皮并于45℃烘箱中烘干24 h，粉碎過60目篩，再加入料液比為1∶20（g/mL）的80%甲醇在40℃下超聲波浸提30 min，抽濾，取上清液待用[14]。

1.3.2 多酚的測定

參考文獻[15]福林-酚試劑比色法測定多酚含量，取1 mL的樣品或標準品，用蒸餾水定容至23 mL，再加入0.5 mL的福林試劑和0.3 mL的10%的碳酸鈉溶液，靜置30 min后，在760 nm波長下測吸光度，多酚的含量以每克樣品中沒食子酸當量表示（mg GAE/g）。

1.3.3 黃酮的測定

參考文獻[16]采用亞硝酸鈉-氯化鋁法測定黃酮含量，移取0.25 mL的樣品或標準品和2.10 mL 30%乙醇到比色管中，再加入0.12 mL的0.5 mol/L亞硝酸鈉溶液，混勻反應5 min后再加入0.12 mL 10%氯化鋁，反應5 min再加入0.8 mL的1 mol/L NaOH溶液，立即在波長510 nm處測吸光度，用30%乙醇空白調(diào)零，黃酮的含量以每克樣品中兒茶素當量表示（mg CE/g）。

1.3.4 花青素含量的測定

參考文獻[17]pH示差法測定花青素含量。用pH1.0的緩沖溶液對樣品進行適當稀釋，直到520 nm下的吸光度值在分光光度計的線性范圍內(nèi)（大多數(shù)分光光度計的吸光度值保持在0.2～1.4的范圍內(nèi)）。采用這個稀釋倍數(shù)，制備兩個測試樣品，一個用pH 1.0的緩沖液稀釋，另一個用pH 4.5的緩沖溶液稀釋。測定分別經(jīng)過pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液稀釋的樣品在520 nm和700 nm波長下的吸光度值，以蒸餾水做空白。樣品制備完畢后要求在20 min～50 min的時間以內(nèi)測定吸光度值。

式中：A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；1為光路長，cm；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；1 000 為 g換算成mg的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3.5 抗氧化活性檢測

3 種抗氧化活性 DPPH·、FRAP、ABTS+·抗氧化活性的測定均參考文獻[18]進行，抗氧化能力用每克樣品中水溶性維生素E當量表示（μmol TE/g）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗平行測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（SD）。利用SPSS17.0軟件統(tǒng)計斯皮爾曼系數(shù)（Spearman）。采用XLSTAT version 10.0軟件進行主成分分析和層序聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。P＜0.05則認為有顯著性差異，P＜0.01則認為有極顯著性差異。

圖1 不同品種柑橘果皮和果肉多酚、黃酮含量比較Fig.1 Comparison of polyphenols and flavonoids in different varieties of citrus

2 結(jié)果與分析

2.1 7種柑橘的抗氧化活性成分分析

不同品種柑橘果皮和果肉多酚、黃酮含量比較結(jié)果見圖1。

由圖1柑橘果皮可知，不同品種柑橘皮的多酚、黃酮含量不同，而且多酚含量顯著高于黃酮含量高。其中塔羅科血橙皮的多酚含量最高，為47.48 mg GAE/g，這可能與其血橙皮中含有一定量的花青素有關(guān)；其次多酚含量由高到低依次排列為椪柑皮、紐荷爾臍橙皮、崀山臍橙皮、錦蜜冰糖橙皮、巴西柚皮、錦紅冰糖橙皮。黃酮含量最多的為紐荷爾臍橙皮，為22.11mgCE/g；其次為崀山臍橙皮、塔羅科血橙皮、巴西柚皮、椪柑皮、錦蜜冰糖橙皮、錦紅冰糖橙皮。相比較而言，塔羅科血橙皮和紐荷爾臍橙皮中多酚、黃酮含量在7種柑橘中是相對較高的。

不同品種柑橘果肉的多酚、黃酮含量（圖1柑橘果肉）也有一定差異，多酚含量比黃酮含量略多。其中錦紅冰糖橙果肉的多酚含量最高（0.75 mg GAE/g）；其次為塔羅科血橙＞紐荷爾臍橙＞崀山臍橙＞錦蜜冰糖橙＞巴西柚＞椪柑。黃酮含量最多的為錦蜜冰糖橙果肉（0.63 mgCE/g）；其次為錦紅冰糖橙果肉、紐荷爾臍橙果肉、巴西柚果肉、塔羅科血橙果肉、椪柑果肉、崀山臍果肉。相比較而言，錦紅冰糖橙和錦蜜冰糖橙中的多酚、黃酮含量相對較高。不同品種的柑橘果皮黃酮、總酚含量均明顯高于果肉，與張元梅[6]研究結(jié)果一致。

2.2 7種柑橘的抗氧化活性

本次試驗通過 DPPH·、FRAP、ABTS+·這 3 種抗氧化測定方法研究了7種湖南地區(qū)柑橘果肉及果皮的抗氧化活性。不同柑橘果肉果皮抗氧化能力比較結(jié)果見圖2。

圖2 不同柑橘果肉果皮抗氧化能力比較Fig.2 Comparison of antioxidant ability of different citrus

柑橘果皮的抗氧化結(jié)果見圖2柑橘果皮。品種不同，柑橘皮中的抗氧化活性具有較明顯差異（P＜0.05）。7種柑橘皮的DPPH·抗氧化活性介于6.95 μmol TE/g～20.21 μmol TE/g，其中抗氧化活性最強的是塔羅科血橙皮，其次分別為：錦蜜冰糖橙皮、崀山臍橙皮、紐荷爾臍橙皮、椪柑皮、巴西柚皮、錦紅冰糖橙皮。FRAP的抗氧化活性在15.38 μmol TE/g～54.76 μmol TE/g之間，抗氧化活性最強的是塔羅科血橙皮，其次依次為錦蜜冰糖橙皮、巴西柚皮、紐荷爾臍橙皮、崀山臍橙皮、椪柑皮、錦紅冰糖橙皮。ABTS+·的抗氧化活性介于 28.11 μmol TE/g～46.46 μmol TE/g，其中抗氧化活性最強的是崀山臍橙皮，其余由高到低依次為：塔羅科血橙皮＞紐荷爾臍橙皮＞錦蜜冰糖橙皮＞椪柑皮巴西柚皮＞錦紅冰糖橙皮。綜上所述，在這7種柑橘中抗氧化活性最強的為塔羅科血橙皮。

柑橘果肉的抗氧化結(jié)果見圖2柑橘果肉。品種不同柑橘果肉中的抗氧化活性具有較明顯差異（P＜0.05）。7種柑橘果肉的DPPH·抗氧化活性介于2.41 μmol TE/g～7.90 μmol TE/g，它們的抗氧化活性由大至小排列的順序為塔羅科血橙＞椪柑＞紐荷爾臍橙＞崀山臍橙＞錦紅冰糖橙＞錦蜜冰糖橙＞巴西柚。FRAP的抗氧化活性在 2.40 μmol TE/g～8.10 μmol TE/g 之間，抗氧化活性最強還是塔羅科血橙果肉，后面依次為錦紅冰糖橙＞崀山臍橙＞紐荷爾臍橙＞錦蜜冰糖橙＞巴西柚＞椪柑。ABTS+·的抗氧化活性介于 8.55 μmol TE/g～20.90 μmol TE/g，抗氧化活性由強到弱依次排列為：塔羅科血橙＞紐荷爾臍橙＞椪柑＞崀山臍橙＞錦蜜冰糖橙＞巴西柚＞錦紅冰糖橙。綜合這3種抗氧化活性測定結(jié)果，可知這7種柑橘中抗氧化活性最強的為塔羅科血橙果肉。無論橙皮還是橙肉，血橙的抗氧化活性均是7種柑橘中抗氧化活性最強的，這可能與血橙含有8種花色苷和4種黃酮類物質(zhì)有關(guān)，血橙中的主要花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3（6"-丙二酰）葡萄糖苷，主要黃酮為蕓香柚皮苷和橙皮苷[19]。

2.3 抗氧化活性成分與抗氧化活性相關(guān)性分析

柑橘的3種抗氧化能力與抗氧化活性成分之間的關(guān)系見表1。

表1 柑橘抗氧化活性成分與抗氧化活性斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)Table 1 Spearman correlation coefficient between antioxidant activity component and antioxidant activity of citrus fruit

由表1可知，3種抗氧化活性能力測定方法中，柑橘的抗氧化能力（DPPH·、FRAP和 ABTS+·）與多酚含量的相關(guān)性最強（r=0.829；r=0.906；r=0.836，P＜0.01），與黃酮的相關(guān)性稍微弱于與多酚的相關(guān)性（r=0.705；r=0.813；r=0.802，P＜0.01）。柑橘中的主要抗氧化活性成分是多酚與黃酮，并且在上述試驗中，多酚含量略大于黃酮含量，由此可見多酚和黃酮對柑橘的抗氧化作用有著重要的影響。

2.4 主成分分析與聚類分析

第一、第二主成分的得分如圖3所示。

圖3 主成分得分圖Fig.3 Score plot of pricinpal component

由統(tǒng)計得到不同品種柑橘樣品的特征值可知，第一主成分具有最大的特征值4.76，能解釋47.63%的總變異；第二和第三主成分特征值分別為1.96，1.51和0.991，能解釋總變異的值分別為19.62%，15.11%和9.99%。前4個主成分能解釋92.27%的總變異；剩下的8個成分只能解釋總變異的7.73%。通過該圖可以將7種柑橘大致分為四部分，I部分為塔羅科血橙（E）；II部分包括椪柑（F）、崀山臍橙（D）、紐荷爾臍橙（C）；III部分為錦紅冰糖橙（A）；IV部分包括錦蜜冰糖橙（B）、巴西柚（G）。

7種不同品種柑橘樣品的因子載荷陣見表2。

根據(jù)Hair F等[20]的PCA理論，載荷因子值≥0.7可用來確定最重要變量和主成分。由表2可知，第一主成分的主要貢獻來自于 PTP（0.91）、PTF（0.74）、PDPPH（0.78）、PABTS（0.86）、JDPPH（0.84）和 JABTS（0.93）；第二主成分的主要貢獻來自于JFRAP（0.95）；第三主成分的主要貢獻分別來自于 JTP（0.50）和 JTP（0.50），第四主成分的主要貢獻分別來自 JTP（0.60）、PTF（0.50）。

表2 柑橘樣品因子載荷陣Table 2 Factor loading matrix of citrus samples

聚類分析可以依據(jù)對象的特征，對其進行分類，從而達到減少研究對象數(shù)目的，當無法確定總共有多少類別時，旨在將性質(zhì)相近的對象歸入同一類中，以便初步判斷哪些品種屬于抗氧化活性較高的品種，有助于實踐中的加工與利用。本試驗對不同品種柑橘的抗氧化活性成分及抗氧化活性能力的差異性進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of clustering analysis

結(jié)合主成分分析可知：在7種不同品種的柑橘中，塔羅科血橙（E）的抗氧化活性成分含量多，抗氧化活性能力最強，因此被歸為I類。而椪柑（F）、崀山臍橙（D）、紐荷爾臍橙（C）含量較多且抗氧化活性能力相當，因此歸為II類。而歸為III類的為錦紅冰糖橙（A）的活性成分含量較高，但是抗氧化性能力相對較弱。考慮到是試驗過程中，樣品存放時間略久，未及時測抗氧化能力導致其抗氧化能力較低。IV類中包括錦蜜冰糖橙（B）、巴西柚（G），它們的抗氧化活性成分少，且抗氧化能力也弱，所以歸為一類。

3 結(jié)論

對7種柑橘抗氧化活性成分及抗氧化活性進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種柑橘果皮的多酚含量在24.77 mg GAE/g～47.48 mg GAE/g之間；黃酮含量在10.47 mg CE/g～22.11 mg CE/g之間，相比較而言，塔羅科血橙皮和紐荷爾臍橙皮中多酚、黃酮含量在7種柑橘中相對較高。7種柑橘果肉的多酚含量在0.43 mg GAE/g～0.75 mg GAE/g之間；黃酮含量在0.29 mg CE/g～0.63 mg CE/g之間。果肉中的多酚和黃酮分別以塔羅科血橙和錦蜜冰糖橙最高，而塔羅科血橙果肉也含有較高的多酚，由此可知塔羅科血橙在7種柑橘中具有相對很高的活性成分含量。此外，在塔羅科血橙果肉還檢測到了其它柑橘沒有的花青素的含量（0.88 mg/g）。DPPH·、FRAP和ABTS+·這3種抗氧化方法來比較不同品種的柑橘果皮和果肉的抗氧化活性也有顯著性差異，綜合比較可知塔羅科血橙果肉和皮的抗氧化活性成分及抗氧化能力最強，這可能與其含有較豐富的花青素有一定的關(guān)系。主成分分析和系統(tǒng)聚類分析將7種的柑橘分成了4類，其中第I類為抗氧化活性成分含量豐富的塔羅科血橙。我國世界上最大的柑橘生產(chǎn)國，每年果汁的加工會產(chǎn)生巨大的皮渣等副產(chǎn)物，本文研究結(jié)果對篩選出具有較好活性成分和抗氧化活性的柑橘果皮，加強柑橘果皮的綜合利用具有一定的參考意義。