張立陽(yáng)，趙雪嬌，劉 帥，趙洪波，張永根*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范中心，黑龍江哈爾濱 150030）

霉菌毒素（Mycotoxins）是霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）調(diào)查指出，在世界范圍內(nèi)超過(guò)25%的糧食作物受到霉菌毒素污染[1]。百奧明公司對(duì)世界范圍內(nèi)19 757份農(nóng)產(chǎn)品樣品進(jìn)行檢測(cè)，指出霉菌毒素在北美及包括中國(guó)在內(nèi)的亞洲北部呈現(xiàn)出重度污染態(tài)勢(shì)，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和黃曲霉毒素B1（AFB1）是最為常見(jiàn)的霉菌毒素[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)同一真菌可產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物，且同種有毒代謝產(chǎn)物也可由多種真菌產(chǎn)生[3]。因而，飼料中霉菌毒素聯(lián)合污染及毒素間聯(lián)合作用逐漸受到研究者們重視[3]。日糧中添加非營(yíng)養(yǎng)性霉菌毒素螯合劑是一種有效降低霉菌毒素危害的方法[4-5]，且一種理想的吸附劑應(yīng)該對(duì)多種霉菌毒素有效[5]，而這種吸附作用主要取決于吸附材料的微觀結(jié)構(gòu)以及電荷總量和電荷分布等[6]。為了提高吸附劑對(duì)霉菌毒素的吸附性能，生產(chǎn)中會(huì)對(duì)吸附劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男蕴幚韀7-8]。本試驗(yàn)采用季銨鹽和載金屬離子對(duì)蒙脫石進(jìn)行改性處理，研究改性前后蒙脫石對(duì)AFB1、ZEN和DON 3種毒素的吸附能力，旨在篩選出最佳改性方法；并對(duì)蒙脫石改性前后結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，探討改性蒙脫石的結(jié)構(gòu)變化，為飼料中霉菌毒素吸附劑的制備和合理使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 蒙脫石購(gòu)自億如科技（北京）有限公司，樣品粉碎過(guò)200目篩（0.075 mm）。改性試劑包括硫酸 銅（CuSO4） 和 硝 酸 鋅（Zn（NO3）2·6H2O）2種供陽(yáng)離子試劑以及十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十八烷基三甲基氯化銨（STAC）、十八烷基二甲基芐基氯化銨（SKC）3種季銨鹽試劑。AFB1、ZEN和DON標(biāo)準(zhǔn)品以及純品購(gòu)買于Sigma，其中標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，毒素純品用于吸附試驗(yàn)。

1.2 吸附材料的改性

1.2.1 載銅載鋅及載銅加鋅改性 準(zhǔn)確稱取20 g吸附材料攪拌分散至300 mL的CuSO4（0.1 mol/L）或Zn（NO3）2·6H2O（6 mmol/L）溶液中得到懸浮液，pH調(diào)整為5.0，在 65 下恒溫?cái)嚢?4～6 h，4 000×g離心 15 min得到沉淀，去離子水反復(fù)沖洗，過(guò)濾。載銅加鋅樣品通過(guò)完成載銅后重復(fù)載鋅的步驟獲得。所有樣品于65 烘干，備用。

1.2.2 季銨鹽改性 準(zhǔn)確稱取20 g吸附材料攪拌分散至裝有300 mL水的500 mL的錐形瓶中，浸泡，攪拌分散，置于80 水浴10 min，使吸附材料在浸泡液中充分溶脹后，加入8 g改性劑，80 ，200 r/min，4 h，離心，蒸餾水清洗至無(wú)Br-和Cl-離子檢出，65 烘干，備用。

1.3 吸附試驗(yàn) 取AFB1、ZEN和DON工作液，加入到含25 mg（0.5%添加量w/v，g/mL）吸附劑的離心管中，以pH 6.0的PBS緩沖液定容至5 mL，使3種毒素濃度為2.0 μg/mL。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以未添加吸附劑的為對(duì)照管。于25 恒溫振蕩水浴鍋中200 r/min下振蕩吸附60 min。吸附結(jié)束后10 000×g離心10 min。取1 mL上清液，加入5 mL三氯甲烷中萃取，氮?dú)獯蹈珊螅匦掠?.0 mL相應(yīng)流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，高效液相色譜（HPLC）上機(jī)檢測(cè)3種毒素濃度。

1.4 蒙脫石改性前后結(jié)構(gòu)表征 利用掃描電鏡（SEM，日立場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡SU8010）分析、X-射線衍射（XRD，BRUKER D8 ADVANCE）分析、傅里葉紅外光譜儀（FTIR，BRUKER ALPHA-T）分析、N2吸附等溫曲線分析、比表面、孔徑分析（BET，Micromeritics ASAP 2460）和有機(jī)元素分析（Elementar Vario III）等技術(shù)對(duì)蒙脫石原料及最佳改性處理后材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，SAS 9.2軟件中ANOVA程序進(jìn)行方差分析，平均值的多重比較采用Duncan′s法進(jìn)行。P＜0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 蒙脫石改性前后對(duì)3種常見(jiàn)霉菌毒素的吸附能力由表1可見(jiàn)，蒙脫石原料本身對(duì)于AFB1有較強(qiáng)的吸附能力，達(dá)67.88%，經(jīng)6種改性處理后，蒙脫石吸附能力均顯著增加（P＜0.05），且以季銨鹽改性處理效果更為明顯，可達(dá)98%以上。蒙脫石原料對(duì)ZEN吸附能力較低，僅為25%左右，經(jīng)改性處理后吸附能力顯著增加（P＜0.05）。蒙脫石原料對(duì)DON的吸附能力與ZEN相近，僅為17%左右，經(jīng)改性處理后，對(duì)DON吸附能力同樣顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但相比于AFB1和ZEN，其增加幅度最小。在所有改性處理中，蒙脫石對(duì)3種毒素的吸附能力表現(xiàn)出共同的特點(diǎn)，季銨鹽改性處理效果均優(yōu)于載金屬離子改性，且STAC處理后蒙脫石對(duì)AFB1、ZEN、DON的吸附能力達(dá)到最大，分別為99.48%、93.62%和65.83%。因而，本試驗(yàn)對(duì)蒙脫石原料和STAC改性蒙脫石進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，以探究吸附效果增強(qiáng)的原因。

2.2 蒙脫石原料及STAC改性后結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 掃描電鏡觀察蒙脫石改性前后表面形貌 由圖1可見(jiàn)，蒙脫石原料呈塊狀結(jié)構(gòu)，疊置片層較多，無(wú)序地堆積在一起，無(wú)明顯折疊現(xiàn)象且厚度較大，邊緣不規(guī)則；經(jīng)STAC改性后的蒙脫石顆粒松散，由于插層反應(yīng)后層間距擴(kuò)大，塊狀轉(zhuǎn)變?yōu)楣饣亩鄬咏Y(jié)構(gòu)。改性蒙脫石出現(xiàn)了更多的剝離、疏松、較平坦的片層，片層大而薄，邊緣更加尖銳有許多清晰可見(jiàn)、凹凸不平的孔洞。

圖1 蒙脫石改性前后掃描電鏡結(jié)構(gòu)表征圖譜

表1 蒙脫石改性前后對(duì)3種常見(jiàn)霉菌毒素的吸附能力

2.2.2 X射線衍射分析蒙脫石改性前后結(jié)構(gòu)特征 由圖2可知，蒙脫石原料及改性處理后X射線衍射角2θ分別為6.02°和3.62°，根據(jù)Brag公式（2dsinθ=nλ）計(jì)算層間距分別為1.45 nm和2.44 nm，表明季銨鹽陽(yáng)離子已成功嵌入了蒙脫石層間。觀察蒙脫石與改性蒙脫石的XRD圖譜發(fā)現(xiàn)，除了首峰位置的不同外，其余不發(fā)生變化，這種現(xiàn)象表明STAC基團(tuán)在交換進(jìn)片層間后，對(duì)蒙脫石的層間距產(chǎn)生影響，對(duì)晶體結(jié)構(gòu)無(wú)影響。

圖2 蒙脫石改性前后X射線衍射圖譜

2.2.3 蒙脫石改性前后比表面、孔體積及孔徑分析 表2數(shù)據(jù)顯示，蒙脫石經(jīng)STAC改性處理后，其比表面積、孔體積及孔徑均顯著增大（P＜0.05），其中比表面積增大最為明顯，數(shù)值約達(dá)到蒙脫石原料的5倍左右，這種變化更有助于蒙脫石吸附能力的增強(qiáng)。

表2 不同吸附材料改性前后表面參數(shù)

2.2.4 傅里葉紅外光譜分析蒙脫石改性前后結(jié)構(gòu)特征 蒙脫石的特征峰（圖3）：1 458 cm-1處的季銨鹽的C-H彎曲振動(dòng)，1 024 cm-1處的Si-O-Si伸縮振動(dòng)峰，515 cm-1處的Si-O-Al彎曲振動(dòng)峰，460 cm-1處的Si-O-Si彎曲振動(dòng)峰。這些吸收峰在改性前后未發(fā)生顯著變化，表明STAC改性對(duì)蒙脫石的晶體結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。但改性處理后，在2 829、2 897 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)較強(qiáng)吸收峰，是STAC改性劑中的C-H伸縮振動(dòng)峰。羥基的伸縮振動(dòng)區(qū)域?yàn)? 300～3 700 cm-1，通過(guò)比較STAC改性前后的紅外圖譜，發(fā)現(xiàn)在3 597 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰較為尖銳且改性前后無(wú)顯著變化，這是蒙脫石層間結(jié)構(gòu)水的羥基伸縮振動(dòng)峰。層間吸附水的羥基伸縮振動(dòng)峰和彎曲振動(dòng)峰分別為出現(xiàn)在3 401 cm-1處寬而矮的峰、1 630 cm-1處的吸收峰。這說(shuō)明STAC改性劑已成功插入了蒙脫石的片層間，親水性大大減弱，脫去了大量層間吸附水，但對(duì)層間的結(jié)構(gòu)水分子無(wú)影響。

圖3 蒙脫石改性前后傅里葉紅外分析（FTIR）圖譜

2.2.5 蒙脫石改性前后氮?dú)獾葴匚浇馕€ 如圖4所示，在相對(duì)壓力p/p°較低的區(qū)域，吸附線平穩(wěn)緩慢上升。在接近p°時(shí)，吸附線才迅速上升。并且在中等相對(duì)壓力下可以觀察到H3滯后環(huán)，此類滯后環(huán)的特點(diǎn)是p/p°在接近p°時(shí)，等溫吸附曲線不會(huì)出現(xiàn)明顯的飽和吸附平臺(tái)，脫附等溫線位于吸附等溫線的上方。

圖4 蒙脫石改性前后氮?dú)獾葴匚浇馕€

2.2.6 蒙脫石改性前后有機(jī)元素含量分析 蒙脫石改性前后的有機(jī)元素分析結(jié)果見(jiàn)表3。改性前，蒙脫石中不含有C、H、N元素，而改性后的蒙脫石中均檢測(cè)到一定的C、H、N元素含量。STAC的分子式為C21H46NCl，3種元素含量增加的幅度與季銨鹽分子中各元素原子數(shù)目的相對(duì)比數(shù)相同，說(shuō)明季銨鹽分子成功交換到了片層中。

3 討 論

表3 吸附材料改性前后有機(jī)元素分析 w%

3.1 蒙脫石改性前后對(duì)3種霉菌毒素的吸附能力 在吸附劑與霉菌毒素的結(jié)合過(guò)程中，霉菌毒素的物理和化學(xué)性質(zhì)是關(guān)鍵因素[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒙脫石原料對(duì)3種霉菌毒素吸附能力由高到低依次為AFB1、ZEN和DON，主要是由于3種毒素分子極性不同造成。AFB1分子量為312，是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)苌?，?個(gè)雙呋喃環(huán)和1個(gè)氧雜萘鄰?fù)瑯O性很強(qiáng)[10]。ZEN分子量為318，為含2個(gè)酚羥基的內(nèi)酯，溶于水，只有在堿性環(huán)境下酯鍵才打開(kāi)，是弱極性或雙極性分子[11]。DON分子質(zhì)量為296.32，化學(xué)名為3α，7α，15-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，屬單端孢霉烯族化合物，分子極性較低。AFB1除末端的雙呋喃環(huán)外，其余部分呈平面結(jié)構(gòu)，更容易進(jìn)入平面層間域。而呈現(xiàn)空間立體結(jié)構(gòu)的ZEN和DON分子因空間位阻效應(yīng)難以進(jìn)入蒙脫石的層間域。因此，極性霉菌毒素AFB1更易被吸附劑有效吸附，而弱極性霉菌毒素ZEN和DON則難以被吸附[12]。

載銅、載鋅是最常見(jiàn)的載金屬離子改性方法，改性處理后，吸附材料的離子交換能力能夠得到加強(qiáng)[13]，且能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的抑菌殺菌作用[14]。季銨鹽改性是改性蒙脫石等吸附材料的一種主要方法。長(zhǎng)碳鏈烷基季銨鹽（如CTAB、STAC和SKC）是使用最多的改性劑，經(jīng)處理后有機(jī)銨陽(yáng)離子進(jìn)入粘土晶層空間，使片層表面得到改性，晶層間距增加，片層表面被有機(jī)離子上的烷基長(zhǎng)碳鏈覆蓋，增加了粘土與高分子的親和性，同時(shí)較長(zhǎng)的烷基分子鏈在片層間以一定方式排列，可使層間距增加，有利于聚合物大分子插層到片層[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)2種改性方式處理后，蒙脫石對(duì)3種霉菌毒素的吸附能力顯著增強(qiáng)，且又以季銨鹽改性處理后脫毒能力變化幅度更高。其中，經(jīng)STAC改性處理后，蒙脫石對(duì)3種霉菌毒素的吸附能力在所有材料及改性處理中最強(qiáng)。

3.2 蒙脫石原料及STAC改性后結(jié)構(gòu)表征 由蒙脫石改性前后對(duì)3種霉菌毒素的吸附能力測(cè)定結(jié)果可知，STAC處理是最佳的改性方式。對(duì)蒙脫石原料及STAC改性后結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，SEM掃描及XRD結(jié)果顯示，改性處理后蒙脫石分子由塊狀結(jié)構(gòu)變?yōu)閷訝罱Y(jié)構(gòu)，且層間距由原來(lái)的1.45 nm增加到2.44 nm。BET分析結(jié)果表明，STAC改性處理使蒙脫石層狀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了更多孔洞，增加了比表面積，比較改性前后吸附等溫線滯后環(huán)，發(fā)現(xiàn)下端閉合點(diǎn)未發(fā)生變化。改性后蒙脫石的滯后環(huán)在相對(duì)壓力p/p°為低于0.4之前就幾乎閉合了，說(shuō)明樣品的微孔孔隙很少，主要是介孔結(jié)構(gòu)。這種變化更有利于霉菌毒素分子進(jìn)入到蒙脫石結(jié)構(gòu)中，與吸附位點(diǎn)發(fā)生作用[16]。

FTIR分析及有機(jī)元素分析結(jié)果表明，STAC分子中烷基長(zhǎng)碳鏈成功插入蒙脫石層間，其排列方式受離子間強(qiáng)烈的范德華力影響，具有平臥單層、傾斜雙層、假三層和超結(jié)構(gòu)等模式，層間距被擴(kuò)大后，能夠容納更多的霉菌毒素。并且吸附劑層間的疏水環(huán)境因表面覆蓋烷基長(zhǎng)鏈被改善，由疏油性變?yōu)橛H油性，對(duì)有機(jī)物的吸附能力增強(qiáng)。陳雪剛等[17]的研究中用STAC和雙十八烷基二甲基氯化銨對(duì)鈉基蒙脫石改性后，水分散體系中，改性劑的添加量增大，吸附劑的層間距也會(huì)隨之?dāng)U大。駱翼等[18]研究也表明，添加相同濃度季銨鹽改性的蒙脫石中，雙季銨鹽改性的蒙脫石比單季銨鹽改性的效果明顯要差，是因?yàn)樾纬擅擅撌瘜娱g疏水性的分子較少。除了蒙脫石和改性劑的結(jié)構(gòu)可以影響吸附劑改性效果外，插層反應(yīng)時(shí)的時(shí)間、溫度、濃度都對(duì)蒙脫石改性也有著重要影響。

4 結(jié) 論

載金屬離子和季銨鹽改性均能顯著提高蒙脫石的脫毒能力，且季銨鹽改性效果更為明顯，其中STAC改性是所有處理中最佳改性方式。改性處理后蒙脫石分子結(jié)構(gòu)疏松，STAC基團(tuán)成功插層到蒙脫石分子結(jié)構(gòu)中，更有利于加強(qiáng)其對(duì)霉菌毒素的吸附能力。