徐芹芹，劉玉芳，康曉龍，方美英

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.中國專利技術(shù)開發(fā)公司，北京 100193；3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056021；4.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

酪氨酸激酶受體3（EphA3）是Eph（Erythropoietin Producing Human Hepatocellular）受體家族中的一員，依據(jù)胞外結(jié)構(gòu)域的序列同源性和優(yōu)先與A類或B類Ephrin結(jié)合的能力可細(xì)分為EphA和EphB 2類[1]。EphA3作為EphA類受體的一員，屬于單次跨膜分子，分子的胞外區(qū)含有配體結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)含有多個磷酸化位點、激酶結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)構(gòu)域（Src同源結(jié)構(gòu)域）等，這些結(jié)構(gòu)決定了EphA3基因的功能[2]。EphA3基因的表達(dá)具有明顯的時空性，在胚胎組織中高表達(dá)[3-4]。此外，EphA3基因參與機體的多種調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。

EphA3基因在毛發(fā)生長過程中發(fā)揮著一定的作用。研究表明，EphA3可以加快生長初期小鼠毛發(fā)的發(fā)育、增加毛囊密度、加快毛囊的成熟過程等[6]。EphA3的表達(dá)貫穿于整個毛發(fā)生長周期：在毛發(fā)生長初期，EphA3在毛囊表皮和上皮細(xì)胞中表達(dá)；在過渡期，EphA3蛋白在新發(fā)育的次級毛芽中被發(fā)現(xiàn)，如毛囊膨大部區(qū)域；在第2個生長周期中，EphA3也在向下生長的毛囊中被檢測到。上述研究表明，EphA3在動物毛發(fā)生長中具有重要的調(diào)控作用[7-8]。結(jié)合本課題組前期實驗結(jié)果[9]，推測EphA3基因可能參與灘羊被毛表型形成的生物學(xué)過程。本研究旨在通過對灘羊EphA3基因編碼區(qū)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析，并結(jié)合其在不同時期的表達(dá)模式，為系統(tǒng)解析EphA3基因在灘羊被毛卷曲形成過程中的作用提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用1月齡及48月齡寧夏灘羊各15只，屠宰后分別取其心臟、肝臟、脾臟、胃、肺、腎臟、眼肌、皮膚組織，放入凍存管中并于液氮中迅速冷凍，然后迅速放入-80 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 灘羊各組織RNA提取 取約40 mg 1月齡和48月齡灘羊的心臟、肝臟、脾臟、胃、肺、腎、眼肌及皮膚組織，采用TriZol與試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）結(jié)合的方法分別進(jìn)行總RNA提取，取出2 μL提取的總RNA在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測完整性，利用NanoDrop 1000進(jìn)行RNA的濃度檢測，其A260/A280值在 1.7～2.0。

1.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 利用反轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄活性，將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（天根生化科技有限公司，北京）。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 冰箱保存。用三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因進(jìn)行普通PCR擴增，檢測反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的質(zhì)量，擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 CDS區(qū)克隆測序 利用Primer 5設(shè)計EphA3基因的CDS區(qū)引物，以NCBI中GenBank提供的預(yù)測綿羊EphA3基因mRNA序列為模板，登錄號為XM_004002 846?？寺phA3基因CDS區(qū)所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。PCR擴增反應(yīng)體系：2×Taq PCR mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各 0.5 μL，模板 1 μL。58 反應(yīng)條件：95 5 min 后進(jìn)入循環(huán)；95 30 s，30 s，72 30 s，34個循環(huán)；72 10 min；4 保存。之后取PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，檢驗PCR產(chǎn)物的質(zhì)量。

將PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接至PMD-18T載體中進(jìn)行單菌株克隆，最后送至測序公司（深圳華大基因科技有限公司，深圳）進(jìn)行單菌株測序。具體實驗操作步驟按照切膠回收試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，北京）和PMD-18T說明書進(jìn)行操作。

表1 擴增目的基因CDS區(qū)的引物

1.5EphA3基因生物信息學(xué)分析 將克隆的灘羊EphA3基因CDS區(qū)的序列與 NCBI上提供的小鼠、大鼠、原雞、牛、黑猩猩、野豬、家貓、非洲象、大熊貓、馬和人的EphA3基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用DNAMAN和ChromosPro軟件進(jìn)行序列拼接比對，采用Cluxtal X和MEGA5進(jìn)行同源性比對及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用在線軟件Epasy（http://web.expasy.org）服務(wù)器上的Protparam、ProtScale等程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的物理特性進(jìn)行預(yù)測；采用NCBI的Conserved Domains在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)保守性預(yù)測；采用TMHMM Server v.2.0在線軟件分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；采用在線軟件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.6 組織表達(dá)譜分析 采用半定量PCR方法研究灘羊EphA3基因在心臟、肝臟、脾臟、胃臟、肺臟、腎臟、眼肌及皮膚組織中的表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參基因。用于半定量的引物（生工生物工程股份有限公司，上海）見表2。

表2 擴增目的基因及持家基因的引物

為了確定半定量的最佳循環(huán)數(shù)，采用不同循環(huán)數(shù)進(jìn)行實驗，最終確定能夠表明EphA3基因在不同組織中的表達(dá)情況。PCR體系參照1.4中反應(yīng)體系，共34個循環(huán)；產(chǎn)物4 保存。之后取PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用于半定量結(jié)果的分析。

1.7 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析 使用Primer 5引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計，參考序列來源同表1。其中EphA3-QF/R為該基因跨越內(nèi)含子設(shè)計的定量引物（表2），以GAPDH基因作為內(nèi)參基因。

將灘羊1月齡及48月齡灘羊各15個個體反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA各取2 μL，混池。以混池cDNA為模板，以2倍稀釋為梯度進(jìn)行稀釋，稀釋5個梯度，制作q-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照熒光定量PCR反應(yīng)體系在CFX96TM Real-Time System定量PCR儀上進(jìn)行實驗，反應(yīng)條件：95 30 s；95 10 s，58 30 s，39 個循環(huán)；95 10 s，4 保存。根據(jù)PCR反應(yīng)的動力曲線圖、線性圖譜和半對數(shù)圖譜選擇適當(dāng)?shù)腸t 值和域值，以得到理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。采用2-△△ct法計算相對表達(dá)量，并利用SAS 8.1（ANOVA）進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 組織總RNA提取結(jié)果 灘羊皮膚組織總RNA提取結(jié)果經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，RNA主條帶清晰，提取質(zhì)量較好，無明顯降解，可用于下游實驗。

2.2 CDS區(qū)克隆測序 用EphA3-1、EphA3-2、EphA3-3 3對引物進(jìn)行PCR擴增，將產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，分別可見目的片段大小的特異性條帶?？寺y序后用DNAMAN對序列進(jìn)行拼接，從而獲得灘羊EphA3基因3 109 bp的核苷酸序列，序列分析發(fā)現(xiàn)包括2 955 bp的完整開放閱讀框，共編碼984個氨基酸。將該序列與綿羊的EphA3基因完整CDS序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其同源性為99.9%，推定該序列即為灘羊EphA3基因的完整CDS序列。

2.3EphA3基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 氨基酸序列分析 利用ExPASy的Protparam軟件對EphA3蛋白質(zhì)序列理化參數(shù)進(jìn)行分析，其蛋白分子式為C4877H7658N1328O1477S53，分子量為110 227.6 u，理論等電點為6.48，總平均親水性（GRAVY）為-0.307，由于GRAVY值的范圍為-2～2，正值表明此蛋白為疏水蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白，所以EphA3蛋白為親水蛋白。

利用NCBI的Conserved Domains在線工具預(yù)測蛋白的保守區(qū)，結(jié)果表明該序列有6個保守區(qū)，分別位于 29～201、263～303、326～432、437～528、617～883、913～975位。其中包括1個配體結(jié)合域EphR_LBD_A3，1個酪氨酸蛋白激酶催化域PTKc_EphR_A，1個SAM結(jié)構(gòu)域，2個Ⅲ型纖連蛋白（fibronectintypeⅢ，F(xiàn)N3）結(jié)構(gòu)域。

利用ExPASy的ProtScale軟件對蛋白質(zhì)親疏水性進(jìn)行分析。氨基酸組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力，蛋白質(zhì)折疊時會形成疏水內(nèi)核和親水表面，同時在潛在跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)存在數(shù)個高分值峰（Scare＞1.5），分別位于 6～15、188～195、545～561、723～727等氨基酸位點區(qū)域；而幾個低分值峰（Scare＜0）分別位于 80、134、237、312、478、576、662、778、868等氨基酸位點附近，這些區(qū)域?qū)俑哂H水性（圖1）。

圖1 EphA3蛋白的親疏水性分析

利用TMHMM Server v.2.0在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)EphA3蛋白含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，其跨膜螺旋區(qū)預(yù)測位置在542～564（圖2）。

圖2 EphA3蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

利用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，綿羊EphA3蛋白富含α-螺旋、延伸鏈及隨機卷曲結(jié)構(gòu)，且跨膜區(qū)所對應(yīng)的序列位置正好存在α-螺旋，這也佐證了跨膜區(qū)域預(yù)測的準(zhǔn)確性（圖3）。

圖3 EphA3蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測簡圖

2.3.2 同源性比較 利用Cluxtal X軟件，將克隆獲得的灘羊EphA3基因CDS區(qū)的序列與小鼠、大鼠、原雞、牛、黑猩猩、野豬、家貓、非洲象、大熊貓、馬和人的EphA3基因相應(yīng)序列進(jìn)行比對。由圖4可見，灘羊EphA3基因核酸序列與牛的同源性最高，為98.5%，與原雞的同源性最低，為81.2%。

圖4 不同物種EphA3基因核苷酸序列差別（下三角）和相似性（上三角）

2.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 用MEGA5軟件將各物種的EphA3基因的核苷酸序列進(jìn)行比對構(gòu)建N-J進(jìn)化樹（圖5），其聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)結(jié)果基本一致，表現(xiàn)為灘羊與牛之間遺傳距離最近，與野豬、馬等哺乳動物遺傳距離次之，與原雞之間的遺傳距離最遠(yuǎn)。這與羊、牛均屬哺乳動物、偶蹄目、?？朴嘘P(guān)，豬雖然也屬偶蹄目，但科目不同，因此呈現(xiàn)出遠(yuǎn)近不同的親緣關(guān)系。由聚類結(jié)果可知，EphA3基因在序列上的同源性很大程度上反映了各物種間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。灘羊EphA3基因CDS區(qū)編碼984個氨基酸，通過蛋白質(zhì)的BlastP比對發(fā)現(xiàn)，灘羊的EphA3蛋白與牛、野豬、大熊貓、人、非洲象的EphA3蛋白同源性較高，分別為99.4%、98.8%、98.5%、97.5%、97.4%。

圖5 各物種EphA3蛋白的N-J進(jìn)化樹

2.4 組織表達(dá)譜 半定量PCR結(jié)果表明，在30～34個循環(huán)數(shù)時，基因表達(dá)量呈線性擴增，而且沒有進(jìn)入平臺期，為達(dá)到理想的實驗效果，本實驗選擇的循環(huán)數(shù)為34 。實驗結(jié)果表明，EphA3基因在灘羊皮膚組織中表達(dá)量最高，在肺臟組織中表達(dá)量較高，在心臟、胃、腎臟、眼肌組織中有微量表達(dá)（圖6）。

圖6 灘羊EphA3基因（上）及GADPH基因（下）在各組織中的表達(dá)

2.5 熒光定量PCR結(jié)果 通過對30個灘羊皮膚組織cDNA混池進(jìn)行2倍的梯度稀釋，即2、2-1、2-2、2-3、2-45個梯度分析目的基因EphA3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖7可見，所有的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析均有1個高相關(guān)系數(shù)（R2=0.991＞0.99），表明不同濃度的混池cDNA的模板擴增與ct值存在良好的線性關(guān)系。目的基因混池cDNA的擴增效率為100.6%，擴增曲線顯示產(chǎn)物擴增重復(fù)性較好。目的基因熔解曲線為單峰，無雜峰，表明熒光定量PCR反應(yīng)過程中無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物產(chǎn)生。故該反應(yīng)條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于EphA3基因的定量分析，所使用的目的基因的引物具有良好的特異性。

圖7 10倍梯度稀釋重組質(zhì)粒DNA擴增形成的EphA3基因擴增曲線（A）、標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）以及熔解曲線（C）

以GAPDH為內(nèi)參基因，經(jīng)過q-PCR檢測并統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，EphA3基因在48月齡灘羊皮膚組織中的相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于1月齡（P＜0.05）。

3 討 論

灘羊是我國寧夏地區(qū)一個重要的地方品種，在灘羊被毛生長過程中被毛的形狀發(fā)生著明顯變化，1月齡灘羊被毛潔白并形成美麗的花穗，稱為“二毛皮”， 特點為毛中短、花穗美觀，具有波浪形花彎俗稱“九道彎”，被當(dāng)?shù)厝嗣褡u為“寧夏五寶”之一的白寶，但是隨著年齡的增長這種特性隨之消失，在48月齡時已經(jīng)觀察不到這種美麗的花紋[10-11]。目前，EphA3對綿羊等經(jīng)濟動物毛發(fā)生長的調(diào)控作用幾乎沒有研究。因此，本研究以不同生長時期灘羊為研究對象，通過對灘羊被皮中EphA3基因編碼區(qū)的克隆、結(jié)構(gòu)特征生物學(xué)分析及表達(dá)模式分析，以期為揭示EphA3參與綿羊毛發(fā)生長的調(diào)控機理及生物學(xué)功能提供依據(jù)。

有文獻(xiàn)報道，EphA3基因能夠參與調(diào)節(jié)與毛發(fā)生長發(fā)育相關(guān)的過程。在人類、鼠等多個物種中都克隆得到了EphA3基因，并對該基因在毛囊生長中的調(diào)控作用進(jìn)行了一系列研究。Yamada等[6]研究發(fā)現(xiàn)，注射了EphA3的老鼠毛囊中顯示了彎曲的球狀部位，這是毛發(fā)生長初期比較獨有的特征，而對照組毛囊則保持垂直，這表明EphA3能夠加速毛囊發(fā)育；同時，注射了EphA3的老鼠每單位長度皮膚中的毛囊數(shù)量明顯增加。毛囊數(shù)量在胚胎期就已經(jīng)決定而且不會在之后的生長過程中發(fā)生改變，一些沒有發(fā)育成完整毛囊的毛芽會消失，然而如果EphA3過量，信號持續(xù)不斷地作用于毛芽，它們就不會退化并可形成完整的毛囊。

本研究通過GenBank上提供的綿羊EphA3基因預(yù)測編碼區(qū)序列設(shè)計了3對特異性引物，首次克隆獲得了灘羊的EphA3基因編碼區(qū)序列，全長2 955 bp，編碼984個氨基酸（提交CDS區(qū)序列）。利用蛋白質(zhì)的BlastP比對分析，發(fā)現(xiàn)灘羊的EphA3蛋白與牛的EphA3蛋白同源性最高（99.4%），與原雞的同源性最低（81.2%）。N-J進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，灘羊EphA3蛋白聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)結(jié)果基本一致，先與牛聚為一類，再與野豬、馬等哺乳動物聚類，最后才與原雞聚為一類，可見EphA3基因在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系與物種本身進(jìn)化模式相似。因此，推斷該基因在不同物種中具有相似的生物學(xué)功能，為后續(xù)研究該基因在毛發(fā)卷曲的生物學(xué)機制中的作用提供依據(jù)。通過對EphA3蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其富含α-螺旋及隨機卷曲結(jié)構(gòu)，而自由卷曲經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異性功能部位；此外，跨膜區(qū)所對應(yīng)的序列位置正好存在α-螺旋，這說明該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域可能是由1個或多個疏水的α-螺旋組成，EphA類受體是單次跨膜蛋白，跨膜結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮生物功能的重要結(jié)構(gòu)，對灘羊EphA3基因結(jié)構(gòu)的探索有助于解析該基因的生物學(xué)功能。EphA3基因在灘羊的皮膚組織中表達(dá)量最高，揭示該基因可能是影響毛發(fā)生長的重要基因之一；而EphA3基因在48月齡灘羊皮膚組織中的相對表達(dá)量顯著高于1月齡，則表明EphA3基因可能在不同月齡灘羊卷曲被毛變化進(jìn)程中具有不可忽視的作用。綜上所述，推測EphA3基因通過一種負(fù)調(diào)控機制參與不同時期灘羊被毛卷曲性狀的分子遺傳機制，但還需要進(jìn)一步的實驗數(shù)據(jù)驗證。

4 結(jié) 論

本研究通過對EphA3基因編碼區(qū)序列的克隆及生物學(xué)信息學(xué)分析，揭示了其主要結(jié)構(gòu)特征；通過組織表達(dá)譜及熒光定量分析，明確了EphA3基因在灘羊各組織中的表達(dá)模式及差異。結(jié)合上述研究結(jié)果，推測EphA3基因在灘羊1月齡和48月齡皮膚組織中的差異表達(dá)可能是調(diào)控灘羊不同時期被毛表型差異的重要基因之一，該研究可為后續(xù)明確EphA3基因調(diào)控灘羊卷曲被毛生長的生物學(xué)機理提供分子依據(jù)。