曹明武 羅 蕊 安 慧 龐秋穎

(東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

菊芋(Helianthustuberosus)是菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)的草本植物，植株高大、生長迅速，具有耐寒、耐旱、耐貧瘠的生物生態(tài)學特性，由于適應性強而在我國各地均有栽培。2004年，菊芋被引入松嫩鹽堿草地，在中度鹽堿程度的退化草地上能夠自然生長，經(jīng)過選育后某些耐鹽堿能力強的品系可以在重度鹽堿程度的退化草地上生長并結出塊莖[1～2]。近十余年，結合菊芋生態(tài)適應性及劣質土地利用，菊芋脅迫生理生態(tài)學研究陸續(xù)開展，并且這些工作主要在國內(nèi)展開。有關菊芋耐鹽性及鹽脅迫下的生理響應、耐鹽機理分析的報道較多，主要涉及鹽脅迫下菊芋不同生態(tài)型、品系的生理響應，如生物量、光合特性、葉片光合放氧速率和PSⅡ反應中心光化學效率、抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)活性等[3～8]，對耐鹽機理的分析則主要涉及到甜菜堿、脯氨酸、可溶性糖等的滲透調節(jié)作用，Na+、Cl-、K+的選擇性吸收以及可能與維持高Na+/K+相關的H+-ATPase的作用等[9～11]。這些研究工作主要是針對葉片、塊莖等菊芋植株而進行，對菊芋懸浮細胞的生理學研究則少有報道。

植物懸浮培養(yǎng)細胞體系具有均一、同質、再現(xiàn)性好等適于精細調控研究的優(yōu)勢。在前期有關萌芽菊芋塊莖對鹽堿土壤脅迫的生理響應及調控機理研究[2,12～13]的基礎上，本文報告菊芋塊莖懸浮細胞對鹽脅迫的生理響應。

1 材料與方法

1.1 菊芋懸浮細胞培養(yǎng)及鹽處理

菊芋塊莖經(jīng)常規(guī)消毒處理后，切成邊長約0.5 cm的小塊，接種于pH6.0、含有BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS固體培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，每3周繼代培養(yǎng)1次。轉接3次后取愈傷組織轉接到pH6.0、含有BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS液體培養(yǎng)基中，置于120 r·min-1的搖床上黑暗培養(yǎng)，20天后繼代1次。繼代后第14天，向培養(yǎng)基中添加NaCl溶液，使培養(yǎng)基鹽濃度分別為50、100、150、200、250 mmol·L-1，并分別補充相應量的無菌水平衡各處理間的培養(yǎng)基濃度。鹽處理后的第1、3、5、7天取樣測定懸浮培養(yǎng)細胞鮮重及相對細胞活力(TTC法)[14]，同時取樣品液氮速凍，備存于-80℃用于懸浮培養(yǎng)細胞干重及生理指標測定。

1.2 生理指標測定

菊芋懸浮細胞中丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量分別采用硫代巴比妥酸法、水合茚三酮法、蒽酮法、考馬斯亮藍G-250染色法測定[14]。按照已建立的方法體系，采用DAB(3,3′-diaminobenzidine)顯色法測定過氧化氫含量[15]，采用商品化抗氧化酶活性測定試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)測定各種抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶)活性。

1.3 酚類物質含量測定

取菊芋懸浮細胞速凍樣品，凍干后以60%乙醇提取總酚，福林酚法測定總酚含量。采用超效液相色譜-質譜聯(lián)用法(UPLC-MS)鑒定并測定14種酚類化合物的含量[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics v17.0軟件進行分析統(tǒng)計，并利用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。

2 結果與分析

2.1 菊芋懸浮細胞的生物量和生理狀態(tài)

隨著NaCl處理濃度的增加，菊芋懸浮細胞的鮮重和干重均呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，表明鹽脅迫明顯抑制了菊芋懸浮細胞的生長(圖1)。當NaCl濃度達到200 mmol·L-1時，菊芋懸浮細胞幾乎停止增長，因此后續(xù)研究中以200 mmol·L-1NaCl作為最高的鹽處理濃度。

圖1 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞生物量的影響Fig.1 Effect of NaCl stress on biomass of suspension cells of H.tuberosus

圖2 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞相對細胞活力的影響Fig.2 Effect of NaCl stress on relative cellular activity of suspension cells of H.tuberosus

圖3 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞可溶性蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of NaCl stress on soluble protein content in suspension cells of H.tuberosus

相對細胞活力進一步反映了菊芋懸浮細胞的生理狀態(tài)。圖2顯示，菊芋懸浮細胞的相對細胞活力隨著NaCl處理濃度的增加呈下降趨勢，這也印證了鹽脅迫對菊芋懸浮細胞生長的抑制?？扇苄缘鞍踪|主要是維系細胞生理代謝過程的重要酶類。隨著NaCl處理濃度的升高，菊芋懸浮細胞中的可溶性蛋白質含量呈先增加而后下降的趨勢，在100 mmol·L-1NaCl處理的第1天、150 mmol·L-1NaCl處理的第5天呈現(xiàn)了最高值(圖3)，這意味著菊芋懸浮細胞中復雜的酶系統(tǒng)對于NaCl脅迫可能有一個從響應到適應的復雜調控過程。

圖4 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞中過氧化氫含量的影響Fig.4 Effect of NaCl stress on hydrogen peroxide content in suspension cells of H.tuberosus

圖5 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞中丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of NaCl stress on malondiadehyde content in suspension cells of H.tuberosus

2.2 菊芋懸浮細胞的氧化脅迫和抗氧化酶活性

雖然隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理的菊芋懸浮細胞中過氧化氫(H2O2)均大量累積，但NaCl處理并未引起細胞內(nèi)H2O2含量的增加(圖4)。丙二醛是細胞膜脂質過氧化的產(chǎn)物之一，通常用于指征細胞內(nèi)發(fā)生的氧化脅迫以及受害程度。從圖5可以看到，150 mmol·L-1以下的NaCl處理沒有導致菊芋懸浮細胞內(nèi)丙二醛含量的明顯增加，200 mmol·L-1NaCl處理的丙二醛含量才顯著增加。隨NaCl處理濃度增加，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)活性呈現(xiàn)增高的趨勢，而過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)可看出明確的變化規(guī)律(圖6)。

圖6 NaCl脅迫下菊芋懸浮細胞中的抗氧化酶活性Fig.6 Antioxidant enzyme activitiesin suspension cells of H.tuberosus under NaCl stress

2.3 菊芋懸浮細胞的酚類物質

一般認為酚類化合物具有較強的抗氧化能力，在植物細胞中發(fā)揮著抗氧化作用，這里對NaCl處理第7天菊芋懸浮細胞的總酚含量和14種酚類化合物含量進行了初步的分析。圖7顯示，150 mmol·L-1NaCl處理下菊芋懸浮細胞中的總酚含量顯著增加，表明酚類物質和抗氧化酶系統(tǒng)共同參與了應對氧化脅迫的抗氧化作用。測定的14種酚類化合物在NaCl處理下的變化不完全相同，隨鹽脅迫強度增強而增加較多的化合物有：羥基苯甲酸類的對羥基苯甲酸，羥基肉桂酸類的3-羥基肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、芥子酸，苯丙烷類的4-羥基香豆素、東莨菪內(nèi)脂，黃酮類的槲皮素、表兒茶素(表1)。

圖7 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞中總酚含量的影響Fig.7 Effect of NaCl stress on total phenols content in suspension cells of H.tuberosus

圖8 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞中脯氨酸含量的影響Fig.8 Effect of NaCl stress on proline content in suspension cells of H.tuberosus

酚類化合物Phenolic compoundsNaCl濃度Concentration of NaCl(mmol·L-1)050150羥基苯甲酸類Hydroxybenzoic acid沒食子酸Gallic acid0.29±0.03a0.15±0.06b0.23±0.03ab原兒茶酸Protocatechuic acid3.11±0.20a1.91±0.07b1.85±0.12b水楊酸Salicylic acid0.19±0.02NDND對羥基苯甲酸p-Hydroxybenzoic acid0.20±0.01b0.18±0.02b0.40±0.04a羥基肉桂酸類Hydroxycinnamic acid3-羥基肉桂酸3-Hydroxycinnamic acid0.18±0.02b0.19±0.03b0.29±0.02a咖啡酸Caffeic acid0.39±0.02b0.52±0.13b0.77±0.16a阿魏酸Ferulic Acid0.03±0.00b0.04±0.00b0.07±0.01a綠原酸Chlorogenic acid0.27±0.05a0.28±0.13a0.56±0.16a芥子酸Sinapic acid0.19±0.01b0.22±0.01b0.56±0.19a苯丙烷類Phenylpropanoid4-羥基香豆素4-Hydroxycoumarin0.06±0.01b0.06±0.00b0.26±0.08a東莨菪內(nèi)脂Scopoletin0.40±0.08b0.54±0.14b1.34±0.25a黃酮類Flavonoid槲皮素Quercetin5.64±0.61b4.94±0.72b11.31±2.80a兒茶素Catechin0.19±0.03a0.16±0.06aND表兒茶素Epicatechin0.18±0.05b0.21±0.05b1.83±0.66a

圖9 NaCl脅迫對菊芋懸浮細胞中可溶性糖含量的影響Fig.9 Effect of NaCl stress on soluble sugar content in suspension cells of H.tuberosus

2.4 菊芋懸浮細胞的滲透調節(jié)

在NaCl處理產(chǎn)生的滲透脅迫下，菊芋懸浮細胞中的脯氨酸含量顯著增加，并且隨著NaCl脅迫強度的增加累積的幅度也明顯增大(圖8)，表明鹽脅迫下菊芋懸浮細胞內(nèi)發(fā)生了明確的滲透調節(jié)過程?？扇苄蕴且脖徽J為是主要的滲透調節(jié)物質，但NaCl處理并未引起菊芋懸浮細胞內(nèi)可溶性糖含量的顯著變化(圖9)，這意味著可溶性糖在菊芋懸浮細胞應對NaCl滲透脅迫的滲透調節(jié)作用中發(fā)揮的作用不大。

3 討論

植物應激鹽脅迫有多種表現(xiàn)形式，如生長速度的改變、形態(tài)特征的變化、生理生化及代謝途徑的調整等。與以往苦苣菜[17]、黃瓜[18]等懸浮細胞的研究結果類似，本研究的結果顯示鹽脅迫也顯著降低了菊芋懸浮細胞的活力，抑制了細胞的生長，并且隨著鹽濃度和處理時間的增加，抑制強度也在增大。

鹽脅迫通常會導致細胞內(nèi)氧自由基積累，積累的氧自由基首先攻擊膜系統(tǒng)，膜脂肪酸中的不飽和鍵被氧化，最終形成丙二醛，因而丙二醛的含量是反應細胞膜脂過氧化作用強弱和脂膜破壞程度的重要指標[19]。同時，細胞內(nèi)也存在有活性氧自由基清除系統(tǒng)即抗氧化系統(tǒng)，防御活性氧對膜脂的攻擊而維持膜結構的完整性。各種抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶)協(xié)作而形成酶促抗氧化系統(tǒng)，而酚類化合物則屬于非酶促抗氧化系統(tǒng)，3-羥基肉桂酸、咖啡酸、芥子酸等能抑制脂質過氧化，槲皮素和表兒茶素等黃酮類物質可以清除自由基，它們具有很強的抗氧化能力，是很好的還原劑、單線態(tài)氧猝滅劑和供氫體[20～22]。本研究結果顯示，150 mmol·L-1以下的NaCl處理沒有導致菊芋懸浮細胞內(nèi)丙二醛含量的明顯增加，200 mmol·L-1NaCl處理的丙二醛含量才顯著增加(圖5)，而過氧化氫含量僅是50 mmol·L-1NaCl處理的略高于對照組，更高的NaCl濃度下又逐漸恢復到近于對照水平(圖4)。這樣的結果并不意味著NaCl處理沒有誘發(fā)菊芋懸浮細胞發(fā)生氧化脅迫，因為伴隨著過氧化氫等活性氧的產(chǎn)生，細胞內(nèi)清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)也在工作，測定的過氧化氫和丙二醛含量只是體現(xiàn)了細胞內(nèi)氧化脅迫與抗氧化系統(tǒng)相互作用后的平衡結果?？箟难徇^氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)活性呈現(xiàn)隨NaCl處理濃度增加而增高的趨勢(圖6)，對羥基苯甲酸、3-羥基肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、芥子酸、4-羥基香豆素、東莨菪內(nèi)脂、槲皮素、表兒茶素等酚類化合物隨NaCl處理濃度的增加也顯著提高了含量(表1、圖7)，說明它們確實發(fā)揮了很好的抗氧化作用。

鹽脅迫対植物的傷害除離子毒害效應外主要是引發(fā)滲透脅迫，作為應答植物則在細胞內(nèi)合成、積累各種滲透調節(jié)物質以規(guī)避滲透脅迫的危害，脯氨酸和可溶性糖被認為是有效的有機滲透調節(jié)物質[23]。從本研究結果看，脯氨酸在菊芋懸浮細胞應對NaCl滲透脅迫的滲透調節(jié)作用中扮演著重要的角色，而可溶性糖發(fā)揮的作用不大。