李樞航 苗 蕊 常 媛 李俊男 燕曉杰 劉照瑩 張榮沭

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040)

山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.pyramidalis)是以山楊(P.davidiana)為母本、新疆楊(P.albavar.pyramidalis)為父本雜交得到的優(yōu)良樹(shù)種[1]。其樹(shù)干通直，樹(shù)姿秀麗美觀，因其耐高寒的特點(diǎn)，常用于北方寒冷地區(qū)[2]。木霉(Trichodermaspp.)對(duì)植物具有多重生防功能，能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)、繁殖和侵染，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)非生物脅迫的抗性[3～4]。另外，木霉能產(chǎn)生與生長(zhǎng)素成分接近的吲哚化合物，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物激素的濃度，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，是一種良好的生物肥料[5～6]。

PIN是一類編碼生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸載體元件的基因家族，影響著高等植物生長(zhǎng)素的外向運(yùn)輸和眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[7～9]。近年來(lái)已在多個(gè)物種中得到克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析。PIN基因家族的成員編碼氨基酸的長(zhǎng)度各不相同，編碼的PIN蛋白中存在一定高度保守的跨膜環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其多肽鏈中部的中央親水環(huán)長(zhǎng)度存在差異[10～11]。PIN基因時(shí)空表達(dá)的特異性與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸高度相關(guān)[12]，而且多個(gè)高度保守的PIN基因的存在，表明生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸存在多條路徑[13]，也從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)PIN家族調(diào)控著植物不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[14]。迄今為止，有關(guān)PIN家族基因克隆和功能分析的研究多集中于草本植物，而對(duì)木本植物有關(guān)的研究相對(duì)較少。

為了揭示木霉菌對(duì)楊樹(shù)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸PIN基因表達(dá)的影響，本研究選擇山新楊作為試材，以未被處理的山新楊組培苗為對(duì)照，分析不同組織中山新楊PodaPIN基因木霉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)量和生長(zhǎng)素含量的變化，研究結(jié)果為揭示PodaPIN基因響應(yīng)木霉菌誘導(dǎo)的表達(dá)規(guī)律提供依據(jù)，并為研究木霉菌的生防機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：山新楊組培苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。采用WPM+NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基對(duì)山新楊組培苗進(jìn)行繼代培養(yǎng)；用WPM+IBA 0.4 mg·L-1培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行生根培養(yǎng)。將120株長(zhǎng)勢(shì)一致的山新楊組培苗(株高為8～10 cm，莖基直徑約為1.5 mm，葉片數(shù)為10～12片，幼根長(zhǎng)1.5～2 cm，生長(zhǎng)條件為溫度26℃，濕度85%，16 h/8 h(光/暗)，光照強(qiáng)度9 000 lx)分為2組，每組30株幼苗。

供試棘孢木霉Ta536(T.asperellumACCC30536，Ta536)，購(gòu)于中國(guó)菌種保藏中心。無(wú)菌條件下，將活化后的木霉接種到PDA培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)5 d獲得大量分生孢子。在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在無(wú)菌條件下，用1/10 WPM液體培養(yǎng)基配制成1 103 cfu·mL-1的分生孢子懸液，備用。

1.2 方法

1.2.1 山新楊與真菌互作實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將WPM液體生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)一致的山新楊組培苗分為2組，每組30株。以未處理的山新楊幼苗為對(duì)照組(CK)；將根部接種棘孢木霉Ta536分生孢子的山新楊幼苗設(shè)為T組；整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌條件下操作。48 h后，分別收集山新楊的莖尖、第5和第6功能葉和根，每10株山新楊的組織材料為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將其迅速置于液氮中，存入-80冰箱備用。

1.2.2PodaPIN9基因克隆

在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的山新楊與木霉菌互作的轉(zhuǎn)錄組最長(zhǎng)基因文庫(kù)中基于基因功能注釋進(jìn)行搜索，獲得Potri.013G087000.v3.0(PodaPIN9)基因的cDNA全長(zhǎng)序列。采用CTAB裂解法提取上述樣本RNA。并用DNaseI(Promega)消化去除DNA。根據(jù)PodaPIN9序列設(shè)計(jì)引物(表1)，RT-PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化并按照說(shuō)明書(shū)將其連接到pMD18-T載體上，送交上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。最后，將基因序列提交到GenBank。

1.2.3PodaPIN9基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI的BLASTx程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì)獲得PodaPIN9同源蛋白序列；利用ExPASy網(wǎng)站中ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/) 分析PIN蛋白的氨基酸組分及理化性質(zhì)。利用NCBI上的ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析PodaPIN9的開(kāi)放讀框長(zhǎng)度；利用NCBI的Conserve Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū)；運(yùn)用Psort Ⅱ prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PodaPIN9蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行PodaPIN9蛋白疏水性分析。利用ClustalX1.81軟件對(duì)PodaPIN9同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并用Mega6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

表1 PCR引物序列

1.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證和數(shù)據(jù)分析

參照羅氏公司第一鏈cDAN反轉(zhuǎn)錄合成酶(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche Co.) protocol)試劑盒，以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋10倍后作RT-qPCR模板。

采用羅氏LightCycler 96 real-time PCR detection system和羅氏FastStart Essential DNA Green Master Mix(Roche)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。所有基因的引物見(jiàn)表1。以Podaactin1(KP973950)，PodaEF1-α(KP973951)和Podaubiquitin(KP973952)3個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參基因。反應(yīng)體系為20 μL：Master Mix，2×conc.(Roche)10 μL，上下游引物各2 μL(5 μmol·L-1)，各采樣時(shí)間點(diǎn)的模板2 μL，加去離子水補(bǔ)足20 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性600 s；95℃變性5 s，59℃退火15 s，72℃延伸10 s，設(shè)45個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件為：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s。為確保實(shí)時(shí)定量RT-qPCR結(jié)果的重現(xiàn)性，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 山新楊I(lǐng)AA提取及含量分析

IAA和IBA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich Co. Shanghai,China)，色譜級(jí)甲醇，甲酸和乙腈來(lái)自Merck公司。參照Z(yǔ)hang[15]的內(nèi)標(biāo)法提取樣品中的IAA，將獲得的提取物定容至1 mL，用0.45 μm PTFE濾器filter過(guò)濾，取10 μl注入系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

色譜分析采用1100 HPLC系統(tǒng)(Agilent,San Jose,CA,USA)，由G1379A在線脫氣裝置，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器和G1312A二元泵組成。Agilent ODS C18反向色譜柱(150 mm×4.6 mm;I.D.,5 μm)串聯(lián)Phenomenex C18預(yù)柱用于分離提取物，柱溫25℃。流動(dòng)相程序參照文獻(xiàn)Zhang[15]執(zhí)行。

質(zhì)譜條件：API3000三重四極桿質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下進(jìn)行操作。參照文獻(xiàn)Zhang和Yao[16]優(yōu)化IAA和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)。采用Analyst software 1.4對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt方法[17]對(duì)PodaPIN9在不同組織和不同誘導(dǎo)條件下的差異表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，公式中的Ct代表熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度值；2-△△Ct是表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組樣品的變化倍數(shù)。采用Excel 2007軟件(Microsoft company,USA)和SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,IBM company,USA)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，分析不同組織中PodaPIN9基因表達(dá)量與內(nèi)源IAA水平的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±SD來(lái)表示。對(duì)處理組(T)與對(duì)照組(CK)間的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P=0.05下比較差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PodaPIN9基因序列分析

獲得的PodaPIN9蛋白編碼區(qū)基因的cDNA長(zhǎng)度為1 044 bp，GenBank登錄號(hào)為MH497373。該基因的起始密碼子在第1 bp處，終止密碼子位于第1 044 bp(圖1A)。共編碼347個(gè)氨基酸，具有完整的Mem_trans(pfam03547)保守域，位于PodaPIN9的第28～996位期間(圖1B)。預(yù)測(cè)該蛋白為親脂性蛋白，屬于膜蛋白。預(yù)測(cè)的PodaPIN9在細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分別占56.5%，21.7%，在液泡中占8.7%，在細(xì)胞核、線粒體、高爾基體中各占4.3%，其中分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的最多，推測(cè)其在物質(zhì)運(yùn)輸、生物合成等過(guò)程中發(fā)揮離子通道載體以及信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

圖1 PodaPIN9編碼序列和預(yù)測(cè)的保守域 A.PodaPIN9編碼序列；B.PodaPIN9預(yù)測(cè)的保守域Fig.1 PodaPIN9 Protein coding sequence and prediction of conservative areas A.Coding sequence of PodaPIN9；B.Prediction of conservative areas of PodaPIN9

2.2 PodaPIN9與6種不同物種PIN基因理化性質(zhì)分析

為分析PodaPIN9與植物PINs的同源性，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到一致性在80%以上，序列覆蓋率達(dá)到99%，閾值為0.0的9條不同物種PINs基因。其中，PodaPIN9與XP_006376058.1(P.trichocarpa)、XP_011014382.1(P.euphratica)、XP_002325466.1(P.trichocarpa)的相似度最高，達(dá)87%～100%；與XP_012088767.1(Jatrophacurcas)和XP_011009309.1(P.euphratica)的氨基酸序列一致性為85%；與XP_021620129.1(Manihotesculenta)的氨基酸序列一致性為84%；而與XP_021681402.1(Heveabrasiliensis)和XP_002512623.1(Ricinuscommunis)的一致性為83%；與XP_021622803.1(M.esculenta)一致性為82%。

這些PIN基因的編碼氨基酸長(zhǎng)度在345～359個(gè)氨基酸之間，其中編碼氨基酸長(zhǎng)度在345～350個(gè)氨基酸的有6個(gè)；氨基酸長(zhǎng)度在351～359個(gè)氨基酸之間的有4個(gè)。其中編碼氨基酸最長(zhǎng)的基因是HbPIN(XP_021681402.1)，長(zhǎng)度為359個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量是39.34 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為6.20；編碼氨基酸最短的基因是PePIN1(XP_011014382.1)，長(zhǎng)度為345個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量是37.68 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為8.11。10種PIN蛋白的等電點(diǎn)變化范圍是6.20(HbPIN)～8.84(PtrPIN2)，除HbPIN編碼酸性蛋白外，其余均為堿性蛋白，表示PIN基因編碼堿性蛋白(表2)。

表2 PINs基因特性

2.3 PodaPIN9蛋白結(jié)構(gòu)與特性分析

將PodaPIN9與另外6個(gè)物種的9條PIN蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析(圖2A)，結(jié)果顯示PINs蛋白具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，在不同植物間也具有高度保守性。推測(cè)這種保守性與PIN蛋白的跨膜運(yùn)輸功能相關(guān)。PodaPIN9中部的親水區(qū)域較短，與橡膠樹(shù)(XP_021681402.1)、木薯(XP_021622803.1)、蓖麻(XP_002512623.1)、麻風(fēng)樹(shù)(XP_012088767.1)PIN蛋白對(duì)比出現(xiàn)一定差異，但與毛果楊PtrPIN1(XP_006376058.1)、PtrPIN2(XP_002325466.1)，胡楊PePIN1(XP_011014382.1)、PePIN2(XP_011009309.1)PIN蛋白對(duì)比顯示高度一致性，推斷PodaPIN9親水區(qū)(C區(qū))結(jié)構(gòu)比較保守。C區(qū)存在3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，均為絲氨酸，分別位于162 aa，166 aa和173 aa處。這些位點(diǎn)影響PodaPIN9蛋白的功能調(diào)控。在C端疏水區(qū)附近存在IM(NPXXY)保守結(jié)構(gòu)，位于198～202 aa處。該結(jié)構(gòu)調(diào)控PIN蛋白的內(nèi)吞作用，對(duì)膜蛋白與受體蛋白的互作起到至關(guān)重要的作用。

對(duì)PodaPIN9的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，共存在9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖2B)。其中在N端有5次跨膜，分別位于10～28，40～62，72～89，96～118和133～152 aa；在C端有4次跨膜，分別位于191～213，228～250，257～279和320～342 aa。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)與蛋白疏水性密切相關(guān)，跨膜區(qū)的數(shù)量直接影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。

蛋白質(zhì)的疏水作用維持著蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的功能與蛋白的親水性和疏水性密切相關(guān)。PodaPIN9由分布在N端和C端的兩個(gè)疏水區(qū)和中間一個(gè)親水區(qū)構(gòu)成，疏水結(jié)構(gòu)主要位于0～156和190～346 aa，每個(gè)疏水區(qū)均有幾次跨膜折疊。在150～190 aa存在明顯的親水結(jié)構(gòu)(圖2C)。

在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTx進(jìn)行序列搜索，獲得19條與PodaPIN9一致性最高的PIN基因序列，采用MEGA軟件NJ法(Neighbor-Joining)構(gòu)建PodaPIN9和與其他植物共20條PIN基因遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖2D)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)進(jìn)化樹(shù)可劃分為5大組。第I組包括月季XP_024189580.1(Rc)、栓皮櫧XP_023900720.1(Qs)、胡桃XP_018824175.1(Jr)、桃樹(shù)XP_007205413.1(Pp)、日本櫻花PQQ14830.1(Py)、甜櫻桃XP_021818394.1(Pa)、獼猴桃PSR92937.1(Ac)、葡萄XP_002279191.1(Vv)、可可樹(shù)XP_017976286.1(Tc)9條PIN基因。PodaPIN9與毛果楊XP_006376058.1(Ptr)、毛果楊XP_002325466.1(Ptr)、胡楊XP_011009309.1(Pe)、胡楊XP_011014382.1(Pe)共同處于第二組，即在通過(guò)BLASTx比對(duì)得到的19條與PodaPIN9相似PIN基因中，毛果楊、胡楊的PIN基因與PodaPIN9親緣關(guān)系很近。其中以毛果楊XP_006376058.1(Ptr)與PodaPIN9親緣關(guān)系最近，毛果楊XP_002325466.1(Ptr)與胡楊XP_011009309.1(Pe)的親緣關(guān)系最近，胡楊XP_011014382.1(Pe)獨(dú)自處于一個(gè)小的進(jìn)化分支。第Ⅰ組與第Ⅱ組處于一個(gè)大的進(jìn)化分支內(nèi)，親緣關(guān)系相對(duì)較近。麻風(fēng)樹(shù)XP_012088767.1(Jc)、木薯XP_021620129.1(Me)、蓖麻XP_002512623.1(Rc)、野草莓XP_004302153.1(Fv)PIN基因處于第Ⅲ組，組內(nèi)物種PIN基因親緣關(guān)系較近，但與第二組的楊樹(shù)PIN基因親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。橡膠樹(shù)XP_021681402.1(Hb)、木薯XP_021622803.1(Me)分別處于第Ⅳ組和第Ⅴ組，與第二組的楊樹(shù)PIN基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 PodaPIN9在不同處理山新楊中的差異表達(dá)

qRT-PCR技術(shù)分析結(jié)果表明，PodaPIN9在山新楊莖尖、第5、6功能葉和根中均有表達(dá)(圖3)。在莖尖中的表達(dá)量最高，是根中503.61±24.74倍；在葉中的表達(dá)量低于莖尖，是根中表達(dá)量的346.15±30.03倍，3個(gè)組織相比根中的表達(dá)量極低。

圖3 PodaPIN9在山新楊不同組織中的差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of PodaPIN9 in P.davidiana×P.alba var. pyramidlis

在莖尖組織中，T組PodaPIN9表達(dá)量下調(diào)，為對(duì)照的0.23倍；在葉組織中，PodaPIN9的表達(dá)量仍然表現(xiàn)為下調(diào)，T組表達(dá)量下調(diào)為對(duì)照的0.63倍；在根組織中，T組PodaPIN9基因表達(dá)量迅速上調(diào)，為對(duì)照的23.51倍(圖4)。說(shuō)明PodaPIN9基因在根組織中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。

圖4 PodaPIN9在不同處理的山新楊不同組織中的差異表達(dá)Fig.4 Differential expression of PodaPIN9 in different treatments of P.davidiana×P.alba var. pyramidlis

2.5 山新楊不同組織中IAA含量分析

山新楊I(lǐng)AA含量檢測(cè)結(jié)果顯示：莖尖的IAA含量最高，是根中的的2.04倍；葉中的IAA含量是根中的的1.34倍。

在莖尖組織中，T組IAA含量高于CK，是對(duì)照的1.01倍。在葉組織中，T組中IAA含量降低，是CK的0.78倍。在根組織中，T組IAA含量升高至CK的1.24倍(圖5)。

圖5 不同處理山新楊各器官中IAA水平Fig.5 IAA level under different treatment in different organs of P.davidiana×P.alba var. pyramidlis

2.6 PodaPIN9差異表達(dá)與IAA水平相關(guān)性分析

為驗(yàn)證PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平的相關(guān)性，將PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析(表3)。結(jié)果表明，在莖尖中，T組PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平相關(guān)性最大，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.989；在葉中，CK組PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性較大(R為-0.918)，而T組中PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)極小，僅為0.146。在根組織中，PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平的相關(guān)性均比較強(qiáng)，尤其是T組，相關(guān)系數(shù)為0.937，呈正相關(guān)。

表3PodaPIN9表達(dá)量與IAA水平Pearson相關(guān)分析

Table3PearsoncorrelationanalysisofPodaPIN9expressionandIAAlevel

莖尖Shoot tip葉Leaf根RootPearsonP值P valuePearsonP值P valuePearsonP值P valuePodaPIN9CK-0.750.46-0.9180.259-0.6230.572T-0.9840.1140.1460.9070.9370.228

3 討論

PIN是一類編碼生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸載體元件的基因家族，影響著高等植物生長(zhǎng)素的外向運(yùn)輸和眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[18]。近年來(lái)已在多個(gè)物種中得到克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析。迄今為止，有關(guān)PIN家族基因克隆和功能分析的研究多集中于草本植物，以擬南芥(Arabidopsisthaliana)[19]、番茄(LycopersiconesculentumMill)[20]、水稻(OryzasativaL.)[21]等植物為代表，多集中于PIN1～PIN4與PIN7的研究，現(xiàn)已比較透徹。本研究選擇具有極高園林價(jià)值與生態(tài)價(jià)值的山新楊作為研究對(duì)象，選取在木霉作用下各組織差異表達(dá)明顯的PodaPIN9。把Potri.013G087000.v3.0蛋白序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，得到結(jié)果與毛果楊PIN5基因100%一致，與胡楊PIN5基因97%一致，在Phypozome12上毛果楊Potri.013G087000被描述為PIN9。根據(jù)這個(gè)描述把Potri.013G087000.v3.0命名為PodaPIN9。對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，與其他物種PIN9基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。PodaPIN9蛋白是一種跨膜蛋白，兩側(cè)為疏水區(qū)，中間為親水區(qū)，靠近羧基端疏水區(qū)存在1個(gè)IM保守結(jié)構(gòu)。本研究推斷PodaPIN9親水區(qū)(C區(qū))較短且結(jié)構(gòu)比較保守。其中每個(gè)疏水區(qū)均有5～6次跨膜折疊，為其跨膜運(yùn)輸功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)PodaPIN9主要分布在細(xì)胞膜(56.5%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(21.7%)和液泡(8.7%)中，推測(cè)其在物質(zhì)運(yùn)輸、生物合成等過(guò)程中發(fā)揮離子通道載體以及信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。PodaPIN9與毛果楊中XP_006376058.1親緣關(guān)系最近，與毛果楊和胡楊中PIN基因親緣關(guān)系很近。Potri.013G087000(PIN9)在莖中高度表達(dá)，qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果表明PodaPIN9在莖尖中表達(dá)量明顯高于在根和功能葉中。這與Carraro N等[22]認(rèn)為PIN9在楊樹(shù)根部表達(dá)量最高不一致。并且與番茄中SlPIN9在根中表達(dá)量最高也不一致[20]。并且發(fā)現(xiàn)PodaPIN9跨膜結(jié)構(gòu)與番茄中SlPIN10跨膜結(jié)構(gòu)十分相近，SlPIN10也是特異性的在根中表達(dá)[20]。這也與PodaPIN9在木霉菌作用下的表達(dá)量變化相符。推測(cè)該類基因表達(dá)易受外界條件變化影響。目前，對(duì)擬南芥AtPIN基因家族中AtPIN1，AtPIN2，AtPIN3～AtPIN8這8條基因功能的研究較多，對(duì)PIN9基因功能的研究相對(duì)較少。PodaPIN9與擬南芥中短PINs成員中的AtPIN5和AtPIN8結(jié)構(gòu)相似，親水環(huán)小于50aa。但AtPIN5和AtPIN8主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[23]。推測(cè)PodaPIN9同屬于短PINs成員，但預(yù)測(cè)的組織分布與AtPIN5存在差異，有待于進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第5和6功能葉中IAA水平與PodaPIN9的表達(dá)量相關(guān)性不大，推測(cè)與葉的生理功能有關(guān)，葉組織不是IAA生物合成的主要部位。而莖尖和根部都是IAA合成的主要部位，受到木霉菌作用的莖尖和根組織中IAA水平均有提高，但與PodaPIN9的表達(dá)量的相關(guān)性并不一致，推測(cè)PodaPIN9對(duì)環(huán)境刺激較為敏感，由于根部受到木霉菌作用，使其與在莖尖部位的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著差異。并推測(cè)木霉處理增加了根中IAA含量，影響了根中IAA向外極性運(yùn)輸，使PodaPIN9的表達(dá)量改變，從而與其它因子協(xié)調(diào)，來(lái)調(diào)控楊樹(shù)苗的生長(zhǎng)發(fā)育。