向運蓉 張 芳 段 靜 黃慧敏 何丹妮 劉 媛 陶建平*

(1.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715； 2.重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室，重慶 400715； 3.西南大學生命科學學院，重慶 400715)

自然界中，植物生長所需的主要資源(土壤、水分、養(yǎng)分、光照、溫度等)存在普遍的空間異質(zhì)性[1]?？λ固厣持校瑤r溶侵蝕和土壤形成均是以土壤為媒介的生物地化反應，這一特殊的形成機制使之具有土層淺薄、土被不連續(xù)、土壤水分虧缺等特征，加劇了喀斯特的生境異質(zhì)性[2～3]。此外，空間尺度上，降雨的不均一及土壤持水的不同使得水分異質(zhì)性成為喀斯特地區(qū)植被生長及分布的主要限制因素[4]。異質(zhì)性生境中，克隆植物能主動搜尋生長所需的資源和有利生境，借助豐富的表型可塑性及生物分配格局的調(diào)整，實現(xiàn)“覓食”，并將同化的有機質(zhì)、糖類等通過克隆器官傳輸至脅迫分株，使其在異質(zhì)生境中迅速定居[5～6]。克隆整合可顯著增加干旱脅迫下植物的生物量、分株存活率和分枝強度[7]，實現(xiàn)分株間的風險分攤和功能分工，最大限度的利用資源和弱化不利影響，維持和提高植株在異質(zhì)性水分下的適合度?？λ固厣持械目寺≌献饔靡环矫嬗欣谥参锍浞掷秘汃ぎ愘|(zhì)環(huán)境中的資源，另一方面也可能對不連續(xù)分布土壤有一定改良作用。因此，喀斯特生境中克隆植物的適應性有重要的研究價值。

植物葉片是進化過程中對環(huán)境變化最敏感且可塑性較強的器官，葉片氣孔是限制水分進出的主要通道。氣孔可通過保衛(wèi)細胞對干旱脅迫及內(nèi)源信號進行感知，然后做出響應以緩解不利影響[8]。研究表明，隨供水量的減少，葉片氣孔開度將減小，阻力增加，氣孔密度也隨之增加，但重度干旱時，氣孔密度會下降[9]。此外，水分的喪失還會影響葉片組織結(jié)構(gòu)，減少柵欄組織和海綿組織厚度，柵海比會隨著供水量的減少逐漸增加[10]。干旱條件下，植物會表現(xiàn)出一系列的生理變化以適應環(huán)境脅迫，但喀斯特地區(qū)的克隆植物會以怎樣的生物量分配格局及葉片結(jié)構(gòu)應對脅迫還知之甚少。本實驗以克隆植物活血丹為材料，對相鄰分株施以不同澆水量，模擬喀斯特生境，探究克隆整合對活血丹生物量積累、分配，葉氣孔及組織特征的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

活血丹(Glechomalongituba)為唇形科(Labiatae)多年生克隆草本，野外考察時發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于喀斯特地區(qū)。實驗所用活血丹幼苗采集于重慶縉云山國家級自然保護區(qū)，在西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室的生態(tài)園培養(yǎng)備用(E106°24′58″，N29°39′10″)。活血丹每個匍匐莖上連接著兩個可進行無性繁殖的分株，每個分株上著生兩片對生葉，葉心形或近腎形，上下表面均被有柔毛。

1.2 實驗處理

本實驗為室內(nèi)模擬控制實驗，開展于生態(tài)園大棚內(nèi)。2017年6月8日于重慶市沙坪壩區(qū)海石公園取回喀斯特黃色石灰土，曬干后敲碎成均勻小顆粒狀，加入定量水混勻，保持相同容重并裝盆。取活血丹苗木并育苗(6月6日)：將一個節(jié)間連接的兩個分株分別種植于相鄰育苗板，培育一個半月后，選取長勢相似的克隆分株移栽至花盆中(不區(qū)分近端與遠端分株，標號為A/B，圖1)，保持匍匐莖連接(K)或切斷(K0)。按照時間段(9月6日～10月26日)內(nèi)重慶近30年的平均降雨量(239.9 mm·m-2)和降雨頻次(3天一次)確定澆水量，設(shè)置4個水分梯度：W1-0%(0 mL/盆)，W2-25%(35 mL/盆)，W3-50%(70 mL/盆)和W4-75%(105 mL/盆)，對A(K-A，K0-A)澆水，B(K-B，K0-B)不澆水，每組6個重復。對所有B株及W1組A株每3天澆10 mL，作為基礎(chǔ)供水量以確保材料成活。待匍匐莖連接的兩個分株(K-A,K-B)長出分枝后采用交互放置的方式，即新長出的分枝交互放置(A花盆長出的分枝放于B花盆中，B分株同理)，既可消除分株間資源傳輸方向的干擾，也可增強分株間的整合強度。

1.3 測定方法

處理結(jié)束后將B株全部取回(交互放置的分株從兩花盆中央垂直位置剪斷，取回B花盆上方所有植株)，測定每個分株的匍匐莖長、節(jié)間數(shù)等。將植株帶回實驗室，分根、莖、葉三部分， 用信封裝好，放入65℃烘箱烘72 h至恒重。用精度0.000 1 g的電子天平稱各部分干重，得到生物量積累及分配數(shù)據(jù)。生物量積累測定指標：根干重、根數(shù)量、根平均長、莖干重、總節(jié)間數(shù)、匍匐莖總長、葉干重、單葉面積、葉片數(shù)。生物量分配計算參數(shù)：葉分配比(葉質(zhì)量/分株質(zhì)量)；莖分配比(莖質(zhì)量/分株質(zhì)量)；根分配比(根質(zhì)量/分株質(zhì)量)；根冠比(地下干重/地上干重)；比葉面積(葉片單面面積/單面葉干重，在每個分株中選取2～4片完全展開且健康的葉片，用根系分析系統(tǒng)(Epson expression 10000 lx)掃描葉片面積，然后將其裝入信封，65℃烘干并稱重，計算比葉面積)。

圖1 實驗處理示意圖 K-A，K-B.匍匐莖連接的兩個分株；K0-A，K0-B.匍匐莖切斷的兩個分株Fig.1 Diagram of experimental processing K-A，K-B.Two branches connected by single stone； K0-A，K0-B.Two branches of stolon abscission

另外，每組處理摘取6～8片生長良好的葉放入密封袋中(后期葉總生物量計算時，按照該株成熟葉片的單葉干重×數(shù)量，將結(jié)果計入葉總干重數(shù)據(jù))，置于冷藏箱帶回實驗室。取出3片立即在下表面涂一層透明指甲油，待其完全風干后，在指甲油上貼一層透明膠帶，壓緊后，迅速撕下，此時肉眼可見膠帶上有一層膜，將其貼于載玻片上，置于顯微鏡(Nikon Eclipse 80 i)下觀察氣孔和表皮細胞形態(tài)。在目鏡(10×)×物鏡(20×)倍數(shù)下觀察氣孔數(shù)目，記錄視野中的氣孔數(shù)及表皮細胞數(shù)；在目鏡(10×)×物鏡(40×)倍數(shù)下觀察氣孔形態(tài)，保存相對清晰的圖像，在ipwin 32中進行氣孔長度和寬度的測量。將其余未處理的冷藏葉片取出，平放在木板上，取出兩塊刀片，用手捏緊后垂直于木板、快速且用力地切下，取出兩刀片間的葉片條，往載玻片上滴一滴清水后把葉片條置于其中，蓋上蓋玻片制成裝片。調(diào)節(jié)顯微鏡，在目鏡(10×)×物鏡(20×)倍數(shù)下觀察葉片橫截面的海綿組織及柵欄組織，并選取較為清晰的圖像進行保存，于ipwin 32中進行海綿組織及柵欄組織寬度的測量。氣孔及組織測定及計算參數(shù)：

氣孔指數(shù)=氣孔數(shù)/(氣孔數(shù)+表皮細胞數(shù))

(1)

氣孔開度=氣孔寬度/氣孔長度

(2)

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

(3)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS(20.0)軟件進行分析，Origin 8.6繪制柱狀圖，HemI 1.0制作相關(guān)性熱圖。用獨立樣本t檢驗(Independentt-test)分析克隆整合與非整合(4個水分梯度下的KB與K0B分別比較)作用下活血丹生物量積累及分配、氣孔指數(shù)、氣孔導度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆整合對生物量積累和分配的影響

2.1.1 克隆整合對生物量積累的影響

克隆整合對活血丹生物量的影響顯著(表1)。整合分株(KB)地下根干重、根數(shù)量均高于非整合組(K0B)，且分別于W4及W3、W4處理時，達到顯著差異水平(P<0.05)，但根平均長在處理間無顯著差異。整合作用可增加莖干重、節(jié)間數(shù)及匍匐莖總長，但均未達到顯著水平。W3、W4；W3、W4及W4水分處理時，葉片干重、單葉面積及葉片數(shù)量分別表現(xiàn)出KB分株顯著高于K0B的趨勢，其他水分處理時，同樣表現(xiàn)為KB>K0B，但未達到顯著差異水平。總而言之，克隆整合有助于活血丹根、莖、葉生物量的積累。

表1 克隆整合對活血丹生物量積累的影響

注：Wi表示水分處理梯度；KB，K0B分別表示克隆整合及非整合B株；不同小寫字母表示同一水分處理時，處理間(KB / K0B)生物量在0.05水平(雙側(cè))差異顯著。

Note:Wirepresented water gradients; KB,K0B indicated ramets B of clonal integration and non integration,respectively;Different lowercase letters meant significant differences between KB and K0B under the same moisture content(P<0.05).

2.1.2 克隆整合對生物量分配的影響

克隆整合對活血丹根、莖、葉生物量分配的影響不盡相同。W1，W2，W4處理時，根生物量比均表現(xiàn)為KB>K0B，且在W4時達到顯著差異水平(P=0.021)(圖2a)。相反，莖生物量比于4個水分處理時均表現(xiàn)為K0B>KB，且在W3及W4水分處理時達到極顯著差異水平(P<0.01)(圖2b)。W1，W2水分處理時，葉生物量比在兩處理組中差異不顯著，但W3，W4處理下KB葉生物量比極顯著高于K0B(圖2c)。整體而言，根冠比表現(xiàn)出KB>K0B的趨勢，且在W4時達顯著差異水平(P=0.023)(圖2d)。比葉面積在W2、W3及W4水分處理時，表現(xiàn)為KB>K0B，且在W4達顯著水平(P=0.037)(圖2e)。綜上，克隆整合對活血丹根、葉的影響大于莖。

2.2 克隆整合對葉片氣孔及組織特征的影響

2.2.1 克隆整合對活血丹葉片氣孔特征的影響

如圖3a所示，活血丹氣孔導度整體表現(xiàn)為克隆整合組>非整合組，且于W1處理時達顯著差異水平(P=0.036)，在W4水分處理時，葉片氣孔導度反而表現(xiàn)為K0B>KB。4個水分處理下氣孔指數(shù)受克隆整合的影響一致(圖3b)，均表現(xiàn)為KB

2.2.2 克隆整合對活血丹葉片組織特征的影響

活血丹克隆整合對葉片組織特征的影響結(jié)果顯示：W2，W3，W4處理時，葉片海綿組織厚度在KB，K0B處理間無顯著差異，而W1處理時卻表現(xiàn)為K0B>KB(P=0.039)(圖4a)。4個水分處理下，葉片柵欄組織受克隆整合的影響各異，其中W1及W4水分處理時，兩分株間無顯著差異，但W2處理時KB極顯著高于K0B(P=0.000)，相反，W3處理時表現(xiàn)為KB顯著低于K0B(P=0.015)。柵欄與海綿組織厚度之和整體表現(xiàn)為非克隆整合組>整合組。柵海比表現(xiàn)為KB>K0B，其中W2及W4處理時達到極顯著差異水平(P<0.01)，但W3處理時卻表現(xiàn)為KB

2.3 活血丹生物量、葉組織及氣孔特征的關(guān)系

不同水分處理時，克隆整合組(KB)生物量、葉片組織及氣孔特征之間的相關(guān)性熱圖(圖5)顯示：澆水量與柵欄組織、柵海比呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與氣孔導度顯著負相關(guān)(P=0.013)，而生物量指標(莖總長、節(jié)間數(shù)、葉干重、葉片數(shù)、根干重、根數(shù)量)與澆水量極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與單葉面積顯著正相關(guān)(P=0.042)。柵欄組織厚度與海綿組織、柵海比存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與生物量指標均存在負相關(guān)關(guān)系，其中莖總長、節(jié)間數(shù)、葉干重、葉片數(shù)、根干重達顯著相關(guān)水平。海綿組織與柵海比存在極顯著負相關(guān)關(guān)系(P=0.000)，與生物量指標負相關(guān)，但均未達顯著水平。同樣，柵海比與生物量之間也存在負相關(guān)關(guān)系，其中莖總長、節(jié)間數(shù)、葉干重、根數(shù)量達顯著水平。整體而言，活血丹莖、葉、根生物量間存在正相關(guān)關(guān)系，且多數(shù)達顯著水平。氣孔指數(shù)與根長顯著負相關(guān)(P=0.042)。氣孔導度與葉片數(shù)、根干重、根數(shù)量間呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

圖2 克隆整合對生物量分配的影響 不同符號表示相同水分處理下，處理間(KB/K0B)生物量分配的比較，下同。Fig.2 The effects of clonal integration on biomass allocation Different symbols represented the comparison of biomass accumulation between KB and K0B under the same moisture content(ns,P>0.05;*,P<0.05;**,P<0.01),the same as below.

圖3 克隆整合對氣孔特征的影響Fig.3 The effects of clonal integration on the characteristics of stoma

圖4 克隆整合對組織特征的影響Fig.4 The effects of clonal integration on the characteristics of tissue

圖5 克隆整合下活血丹生物量、葉組織及氣孔特征的相關(guān)性熱圖 WT.水分處理；PT.柵欄組織；ST.海綿組織；P/S.柵海比；SDW.莖干重；TSL.莖總長；TIN.節(jié)間數(shù)；LDW.葉干重；NL.葉片數(shù)；LA.單葉面積；RDW.根干重；ARL.根平均長；NR.根數(shù)量；SI.氣孔指數(shù)；SC.氣孔導度Fig.5 Correlation thermal map of along biomass, leaves tissue with stomata of G.longituba with clonal integration WT.Water treatment; PT.Palisade tissue; ST.Spongy tissue; P/S.Palisade/ spongy tissue; SDW.Stem dry weight; TSL.Total stolon length; TIN.Total internode number; LDW.Leaves dry weight; NL.Number of leaves; LA.Single leaf area; RDW.Roots dry weight; ARL.Average root length; NR.Number of roots; SI.Stomatal indices; SC.Stomatal conductance

3 討論

異質(zhì)性是生物生境的基本屬性，西南喀斯特地區(qū)因巖溶侵蝕、巖石裸露，導致土壤斑塊性分布，面臨著普遍的生境異質(zhì)性[11～12]，嚴重影響著植被的群落組成和生物量分配格局?？寺≈参镌诋愘|(zhì)性生境中表現(xiàn)出諸多的適應性特點，如表型可塑性、覓食、功能特化、克隆分工等，可緩解局部資源匱乏帶來的壓力并加速逃避不利生境，是克隆植物在異質(zhì)性生境中定植、生長的重要策略[13～15]。

克隆植物可將分株的放置格局(分株匍匐莖長度、根長度、葉數(shù)量等構(gòu)件特征參數(shù)[16～19])與資源異質(zhì)性進行精密協(xié)調(diào)以提高對生境的適合度。本研究中，克隆整合顯著增加了干旱生境中活血丹的根、莖、葉生物量，根數(shù)量、匍匐莖總長、葉片數(shù)也顯著增加。這與其他克隆植物(Mikaniamicrantha,Irisjaponica,Bisongrass)在異質(zhì)性水分處理下的反應是一樣的[20～22]。植株地上生物量的增加有助于光能固定，地下根系的延伸可獲取更多礦質(zhì)養(yǎng)分，資源的有效攝取使得克隆植物在異質(zhì)性生境中迅速定居[23]。此外，活血丹單葉面積、根長度也受克隆整合影響而增加。這表明干旱生境中克隆分株葉面積及根長的整合“修飾”對植物形態(tài)可塑性的放大，具有特殊的生態(tài)適應意義。

植物的能量分配格局反映了植株在生長過程中對環(huán)境的響應規(guī)律及能量分配對策，使其對生長、維持、繁殖等功能進行資源權(quán)衡[24]?？寺≈参镌诿{迫生境中的能量分配以“覓食”為主[25]。本研究表明，克隆整合可顯著增加活血丹根、葉生物量比，增加根冠比和比葉面積。董鳴的研究結(jié)果也顯示，克隆整合可增加蛇莓的根、葉分配比[26]。對植株根、葉的投資有助于植物的覓食，使得干旱脅迫得到一定緩解。此外，非整合分株的莖生物量比高于整合分株，表明非整合分株在極端環(huán)境中可通過莖的延伸覓食資源應對脅迫，莖的生長可以增加獨立分株的生存機會，通過分株風險分攤降低基株的死亡風險。何軍等的研究同樣表明，互花米草在干旱生境中，會通過莖的延伸獲取資源[7]。

葉片氣孔是CO2進出葉肉細胞及水分蒸騰散失的重要門戶，其孔徑的大小直接影響著蒸騰作用和光合作用的進行[27]。Kubota等[28]和Wang等[29]的研究表明，干旱脅迫時，氣孔呈現(xiàn)出“小而密”的變化趨勢，以減少水分的蒸騰散失[28～29]。本研究顯示活血丹葉片下表皮氣孔導度整體表現(xiàn)為KB>K0B，表明克隆整合的存在對氣孔導度的增加可減緩干旱對植株的影響。氣孔導度的增加可促進CO2流通，有助于光合作用的進行。但在W4水分處理時，氣孔導度反而呈現(xiàn)出非整合分株高于整合分株的趨勢，這可能是實驗開展時間段為秋季多雨天氣，而W4處理時，脅迫分株所需資源由匍匐莖傳輸供給，所以葉片光合作用減弱，氣孔導度降低。氣孔指數(shù)呈現(xiàn)出K0B>KB的趨勢，表明非整合分株在極端環(huán)境中以高密度的氣孔應對干旱脅迫。

柵欄組織與海綿組織的分化程度可反映環(huán)境水分狀況[30]。葉肉柵欄組織發(fā)達，海綿組織厚度相對減少是植物對水分短缺的響應[31]。本研究中，匍匐莖連接的活血丹分株葉片海綿組織厚度在處理間差異不顯著，但柵欄組織厚度、柵海比卻呈現(xiàn)出KB

綜上所述，克隆整合可顯著增加活血丹生物量及根、葉生物量分配比(根生物量比、葉生物量比、根冠比、比葉面積)，降低對莖生物量的分配。克隆整合會增加葉片氣孔導度，降低氣孔指數(shù)。海綿組織受克隆整合影響較小，但柵欄組織及柵海比表現(xiàn)為非整合分株高于整合分株。表明克隆整合可改善植株生物量積累及分配以適應異質(zhì)性生境，可增加根、葉的生物量投資及調(diào)整葉氣孔和組織占比以適應干旱脅迫，有助于在水分異質(zhì)性頻發(fā)的喀斯特生境中生存和定居，提高植被覆蓋率。