王信 羅麗婭 肖雪 王勇朋 陽琰 王哲 張旋 李琪 樊思桐 朱玉玉

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類的健康。多年來大多數(shù)研究一直從糖尿病與胰腺之間的關(guān)系入手，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，說明糖尿病發(fā)病不僅僅是胰腺問題。25羥維生素D[25 hydroxyvitamin D，25(OH)D]與糖尿病及其并發(fā)癥、骨代謝等均有關(guān)[1-3]。25(OH)D不僅可以改善骨代謝，對(duì)保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)有一定的作用，短期補(bǔ)充25(OH)D能改善胰島β細(xì)胞功能[4-5]。25(OH)D對(duì)骨形成的影響包括間接作用和對(duì)成骨細(xì)胞的直接作用。一方面，25(OH)D通過促進(jìn)腸道鈣吸收，提高血鈣的濃度，為骨礦化提供必需的原料，從而間接作用于骨形成。此外，成骨細(xì)胞表達(dá)維生素D受體，是25(OH)D作用的重要靶器官，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也顯示維生素D可促進(jìn)人成骨細(xì)胞分化、礦化[6]。Runx2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)的靶目標(biāo)，是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的重要因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了成骨細(xì)胞的生理過程[7]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的分化、增殖中發(fā)揮重要作用，對(duì)骨形成、代謝均起著重要的調(diào)控作用[8]。過表達(dá)的PPARγ可使Wnt信號(hào)通路失活，下調(diào)Runx2表達(dá)，促進(jìn)脂肪形成，使得骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，這是脂代謝紊亂與骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)這兩種疾病相互影響的重要生理基礎(chǔ)[9]。目前對(duì)于外周血中Runx2 mRNA表達(dá)在不同骨量狀態(tài)下糖尿病患者之間差異及其與25(OH)D的關(guān)系，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬通過檢測(cè)不同骨量狀態(tài)下2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者外周血中Runx2 mRNA的表達(dá)，初步探討外周血中Runx2 mRNA表達(dá)與25(OH)D的關(guān)系，可能為2型糖尿病、OP的早期聯(lián)合防治提供新的視點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年7月至2017年6月就診于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的初診T2DM患者150例，據(jù)骨密度測(cè)定結(jié)果分為： T2DM+骨量正常組(A組)50例[年齡(60.5±7.2)歲，男25例，女25例]；T2DM合并骨量減少組(B組)50例[年齡(59.4±6.7)歲，男24例，女26例]；T2DM合并骨質(zhì)疏松組(C組)50例[年齡(61.0±6.1)歲，男26例，女24例]。選取遵義醫(yī)學(xué)院體檢中心年齡、性別相匹配的健康對(duì)照者(NC組)50例[年齡(59.9±7.1)歲，男25例，女25例]。取得所有受試者的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)1年以上的女性及年齡≥60歲的男性；②2型糖尿病診斷均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為新診斷的2型糖尿病患者；③骨質(zhì)疏松診斷符合1994年WHO 制定的OP診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過雙能X線骨密度儀測(cè)定確診；④18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2；⑤未接受過任何糖尿病降糖治療措施，包括飲食、運(yùn)動(dòng)療法；⑥肝腎功能正常，無其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病及糖尿病急、慢性并發(fā)癥；⑦正常對(duì)照組無糖尿病及痛風(fēng)家族史；⑧無吸煙史及長期大量飲酒史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1型糖尿病或其他特殊類型糖尿?。虎谟懈哐獕翰∈?、心腦血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、惡性腫瘤病史，合并甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能低下、甲狀旁腺疾病、代謝性骨病等內(nèi)分泌疾病；③妊娠或哺乳期婦女或長期服用避孕藥的婦女；④近1個(gè)月內(nèi)使用過影響糖、脂代謝及其他影響體內(nèi)25(OH)D代謝的藥物。⑤近一個(gè)月內(nèi)使用過影響骨代謝的藥物如降脂藥、類固醇、甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素及降糖藥物(TZD、SGLT2I和胰島素)等。

1.2 研究方法

1.2.1血漿25(OH)D及生化指標(biāo)的檢測(cè)：研究對(duì)象試驗(yàn)前禁食12 h，禁飲8 h，空腹抽靜脈血，測(cè)血脂、血糖、胰島素。電化學(xué)發(fā)光法(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)測(cè)25(OH)D，高壓液相色譜法測(cè)定糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)(試劑為美國伯樂D-10配套試劑),Olympus(AU2700)全自動(dòng)分析儀檢測(cè)總膽固醇(triglycerides，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(lipoprotein-cholesterol，LDL-C)，測(cè)定空腹胰島素(fasting plasma insulin，F(xiàn)INS)采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定含量(試劑盒購于Roche Diagnostics GmbH)，測(cè)定空腹血漿葡萄糖(fasting plasma ghlcose，F(xiàn)PG)采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高壓液相法測(cè)定。Real Time-PCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)。測(cè)血壓、身高、體重，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(kg/m2)、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.2RNA的提取和cDNA的合成：對(duì)所有研究對(duì)象采集5 mL外周靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝。采用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離淋巴細(xì)胞，然后用Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在260 nm/280 nm波長處的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1純度符合要求?？俶RNA 提取試劑盒及第一條鏈合成試劑盒由Promega公司提供；Real time PCR 熒光定量試劑盒由Promega公司提供。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3Real time PCR 熒光定量反應(yīng)體系及過程：提取血漿中總RNA，以總RNA 1.5μg為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄總的反應(yīng)體積是20 μL。Runx2引物正義：5′-GCTATTAAAGTGACAGTGGACGG-3′；反義：5′-GGCGATCAGAGAACAAACTAG-3′；β-acti引物正義：5′TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3′；反義：5′ TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，55 ℃～73 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)28～30次，75 ℃終末延伸5 min。退火溫度和循環(huán)次數(shù)Runx2 55 ℃，30個(gè)循環(huán)；β-actin 58 ℃，28個(gè)循環(huán)。為了校正誤差，本研究利用管家基因β-actin 作為內(nèi)參，以待測(cè)樣品目的基因的拷貝數(shù)平均值除以該樣品內(nèi)參基因的拷貝數(shù)平均值，得到目的基因的相對(duì)含量。樣品中模板的拷貝數(shù)，可由SDS 軟件通過所得到的Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得到。

1.2.4設(shè)計(jì)合成引物：通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Gene數(shù)據(jù)庫，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列號(hào)，然后用Primer-BLAST比對(duì)引物特異性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列見表1。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測(cè)定) Table 1 Specific primers used for real-time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床指標(biāo)比較

與NC組比較，A、B、C組FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與A組比較，B、C組HbA1c、HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組25(OH)D水平顯著低于NC組、A組及B組；B組低于NC組及A組；A組低于NC組，4組間25(OH)D水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，即 C組0.05)。見表2。

2.2 Real time PCR 檢測(cè)Runx2 mRNA 的表達(dá)

A組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.256，P<0.05)；B組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.522，P<0.05)；C組與NC組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.522，P<0.05)；A組與B組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.232，P<0.05)；A組與C組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.232，P<0.05)；B組與C組相比，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.232，P<0.05)。見表3。

表2 4組間一般臨床資料及25(OH)D水平的比較 Table 2 Comparison of general characteristics and serum 25-OH vitamin D levels among the four groups

注：和NC組比較,*P<0.05；和A 組比較，#P<0.05；和B組比較，△P<0.05。

表3 各組中Runx2 mRNA的表達(dá)Table 3 The expression of Runx2 mRNA

注：和NC組比較，1P<0.05；和A組比較，2P<0.05；和B組比較，3P<0.05。

2.3 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果

血漿中25(OH)D與性別、年齡、血壓、BMI、TC、HDL-C、LDL-C比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Runx2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.548，P<0.05)，與HbAlc、HOMA-IR、TG呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為-0.315、-0.323、-0.348，P<0.05)。見表4。

表4血漿中25(OH)D水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

Table4Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical indicators

項(xiàng)目25(OH)Dr值P值HbAlC-0.3150.025HOMA-IR-0.3230.023TG-0.3480.041Runx2 mRNA0.5480.025

3 討論

糖尿病作為一種慢性全身性代謝性疾病，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活方式的改變及人口老齡化，目前在全球呈爆發(fā)趨勢(shì)。2013年糖尿病患病人數(shù)達(dá)到3.82億，預(yù)計(jì)到2030年全球患糖尿病的人數(shù)將達(dá)到約4.4億[10]，其中，2型糖尿病占90%以上，因其高發(fā)病率、高致殘率而引起人們高度關(guān)注。我國至少有6 944萬人患有OP，2.1億人存在低骨量，估計(jì)每年用于治療OP引起中老年患者骨折的費(fèi)用已高達(dá)104億人民幣，而到2020年將超過217億[11]。有研究顯示，血糖水平控制較差的 T2DM 患者因骨量減少而引起骨折的風(fēng)險(xiǎn)較血糖控制良好者及非 T2DM人群高47%～62%[12]。T2DM、骨質(zhì)疏松癥，它們看似獨(dú)立的疾病，但它們往往并存于同一個(gè)體，使患者生活質(zhì)量更趨下降，加重了家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。OP已成為我國第4位常見慢性疾病，T2DM人群中OP的發(fā)病率也明顯高于正常對(duì)照組[13]。T2DM合并OP是指患者體內(nèi)代謝失衡、骨密度減低導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性增加，從而使得骨折風(fēng)險(xiǎn)大大增加的一種全身性代謝性骨病[14]，給患者帶來極大的困苦。由此可見，T2DM、OP這兩種疾病均已成為世界上非常普遍的全身代謝性疾病。維生素D 缺乏者不僅容易患骨質(zhì)疏松，更易患代謝綜合征及糖尿病[15]，糖尿病患者中普遍存在維生素D水平的缺乏[16]。Runx2是成骨細(xì)胞的特意轉(zhuǎn)錄因子，可通過結(jié)合成骨細(xì)胞特異性原件[17]。Runx2表達(dá)可以促進(jìn)脂肪形成，使得骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致OP，但是目前國內(nèi)外未見T2DM合并不同骨量患者血漿中Runx2 mRNA表達(dá)與25(OH)D之間的關(guān)系的研究報(bào)道，因此，本研究擬從這一問題入手進(jìn)行探索，可能對(duì)臨床早期聯(lián)合防治糖尿病、OP具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3處理OB分化時(shí)，OB特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix等表達(dá)增加，使OB分化增強(qiáng)，1,25(OH)2D3可能通過下調(diào)PPARγ、SFRP1(secreted frizzled-related proteins，SFRP 1)表達(dá)，上調(diào)Osterix的表達(dá)，繼而激活β-catenin信號(hào)通路，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過β-catenin/Tef-1介導(dǎo)的成骨性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活化促進(jìn)骨的形成[18]，從而阻斷脂肪細(xì)胞分化，減少外周組織胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，對(duì)OB的功能有積極保護(hù)作用[19]。生理劑量的1,25(OH)2D3可抑制OB增殖、促進(jìn)OB分化，補(bǔ)充維生素D可以有效抑制肥胖，改善血脂代謝紊亂，抑制脂肪生成，減輕IR[20]。維生素D有降血脂作用，且25(OH)D與TG之間存在線性負(fù)相關(guān)[21]，維生素D與IR、體脂密切相關(guān)[22-23]。由此可推測(cè)，維生素D與糖尿病、OP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果示，與NC組比較，A、B、C組FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均顯著升高，而HDL-C明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與A組比較，B、C組HbA1c、HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組25(OH)D水平顯著低于NC組、A組及B組；B組低于NC組及A組；A組低于NC組，4組間25(OH)D水平呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，即 C組

本研究結(jié)果提示，外周血中Runx2 mRNA表達(dá)及25(OH)D參與了糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展，可能機(jī)制是外周血中Runx2 mRNA表達(dá)減少，維生素復(fù)合物形成減少，血漿中25(OH)D減少，維生素D的生物學(xué)效應(yīng)降低，從而引起糖、脂、骨代謝紊亂，導(dǎo)致糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展。反過來，糖尿病、OP的發(fā)生發(fā)展，促使血漿中25(OH)D水平進(jìn)一步減低，這就形成了一個(gè)惡性循環(huán)。因此，積極補(bǔ)充維生素D可能會(huì)打破這一惡性循環(huán)，可能也會(huì)改善外周血中Runx2 mRNA的表達(dá)，對(duì)T2DM、OP的防治具有非常重要的作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索。