馬永海 鞏棟 王偉 邵隴龍 甄平

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 3.解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730050

在過去20年中，特別是發(fā)展中國家，隨著多藥耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)及艾滋病患者的增加，骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病率呈上升趨勢。骨結(jié)核病灶手術(shù)清除后給予抗結(jié)核治療是治療骨結(jié)核的基本方法。目前病灶清除術(shù)后通過口服或局部用藥方式抗結(jié)核。由于病灶區(qū)慢性炎癥導(dǎo)致纖維結(jié)體組織形成，局部血運差，口服用藥難以在病灶區(qū)內(nèi)達到有效的殺菌濃度，當(dāng)機體免疫功能下降時容易導(dǎo)致結(jié)核復(fù)發(fā)，同時抗結(jié)核藥物治療的周期長，毒副作用較為明顯，患者很難堅持每天服藥[1-2]。近十年來，許多研究人員和臨床醫(yī)師嘗試局部用藥，提高抗癆療效[1, 3]。但是清創(chuàng)術(shù)后采用緩釋體治療骨結(jié)核是否影響骨愈合，以及將緩釋的濃度控制在什么范圍，既能達到有效殺菌濃度又不影響病灶骨愈合等問題，值得探討和研究。異煙肼(isoniazid， INH)和利福平(rifampin，RFP)均有較強抗菌作用，且兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用。本研究將針對不同濃度抗結(jié)核藥物INH和RFP聯(lián)合應(yīng)用對大鼠成骨細胞(osteoblasts，OB)的增殖、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、I型膠原蛋白表達和OB成熟與礦化能力的影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生(出生24 h內(nèi))清潔級SD乳鼠5只，雌雄不限，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物中心提供。

1.2 實驗試劑

異煙肼原藥(Sigma公司，純度>99%)；利福平原藥(Sigma公司，純度>99%)；胎牛血清(蘭州榮曄生物公司)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；免疫熒光二抗羊抗兔(KPL)、一抗兔抗鼠(Abcam公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(北京索萊寶)；牛血清蛋白、磷酸鹽緩沖液、CellCountingKit-8(日本同仁)、TritonX-100(上海碧云天公司)、PBS(上海碧云天公司)；堿性磷酸酶活性測試盒(南京建成公司)。

1.3 方法

1.3.1成骨細胞分離培養(yǎng)：取5只新生SD大鼠處死后浸泡于75%的乙醇中15 min，在無菌條件下取其顱骨并去除結(jié)締組織，PBS漂洗3次。將顱骨剪成約1 mm×1 mm大小的碎片，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰蛋白酶2～3 mL，37 ℃預(yù)消化10 min，棄消化液后重復(fù)1次。換0.1%Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化3次，37 ℃每次消化20 min，收集并合并消化液，200目細胞篩過濾3次，濾液1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液懸浮，吹打均勻并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至3×104個細胞/mL，在飽和濕度、5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，鏡下觀察當(dāng)細胞鋪滿皿底80%后，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2藥物處理：成骨細胞采用含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2。實驗開始24 h前將細胞用PBS洗滌后換用無血清α-MEM培養(yǎng)基饑餓處理。分為對照組和實驗組，實驗組分別加入不同濃度的INH+RFP [(10+3)μg/mL、(20+6) μg/mL、(30+12) μg/mL、(40+24) μg/mL、(50+48) μg/mL)]。INH和RFP用二甲基甲酰胺(EDMF)溶解后，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。(1)不同濃度INH、RFP對成骨細胞細胞增殖的影響。取第3代成骨細胞，用含0.02%四乙酸乙二胺(EDTA)的0.25%胰酶消化，制成DMEM細胞懸液，以5×104/孔接種于48孔板中。48孔板隨機設(shè)對照組和實驗組，每組設(shè)5個重復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后待細胞貼壁后去除培養(yǎng)液，對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h后取出48孔板，每孔加入CCK-8 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)0.5 h后分別用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，然后選取吸光度比較適宜的時間點作為后續(xù)試驗時間點。(2)不同濃度INH+RFP對成骨細胞ALP活性的影響。將P1代細胞以5×104/孔接種于48孔板中，共2板，48孔板隨機設(shè)對照組和實驗組。對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，每組設(shè)5個重復(fù)孔，培養(yǎng)3 d和6 d后檢測細胞內(nèi)ALP活性，采用ALP活性測定試劑盒檢測。實驗步驟如下：棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.25 mL，混勻，37 ℃水浴15 min后，加入0.75 mL顯色液，在520 nm波長下測定酚標(biāo)準(zhǔn)及樣本的吸光值。(3)不同濃度INH、RFP對成骨細胞Ⅰ型膠原的表達。將P1代細胞以1×105進行爬片培養(yǎng)，12 h后隨機設(shè)對照組和實驗組。對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后取出爬片并用PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min。PBS漂洗3次后滴加免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，勿洗，滴加Ⅰ型膠原抗體 (1∶500)并4 ℃過夜，次日PBS漂洗3次，每次3 min，之后滴加免疫熒光二抗(1∶1000)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次3 min，抗熒光封片液封片，熒光顯微鏡觀察不同組間細胞中Ⅰ型膠原表達的情況。Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定灰度值。(4)茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色。將傳代后的細胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿隨機設(shè)對照組和實驗組，對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，對其進行染色。具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，加入4%多聚甲醛溶液固定10 min，棄固定液，加入pH 值為8.9、0.1%的茜素紅染色液，37 ℃水浴45 min，蒸餾水清洗，換固定液照相記錄結(jié)果。同時采用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描鈣化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和灰度，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度INH+RFP對成骨細胞細胞增殖的影響

如圖1所示，INH、RFP聯(lián)合作用于大鼠成骨細胞24 h后，(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他實驗組細胞活性顯著低于對

照組(P<0.05)。結(jié)果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

圖1 各組大鼠成骨細胞CCK8定量結(jié)果(與對照組比較，*P<0.05)Fig.1 CCK8 quantitative results of rat osteoblasts in each group (compared with the control group,*P<0.05)

2.2 不同濃度INH、RFP對成骨細胞ALP活性的影響

INH、RFP聯(lián)合作用于成骨細胞3 d、6 d后檢測細胞的ALP活性，如圖2所示。3 d和6 d (10+3) μg/mL組的ALP活性與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各實驗組都顯著低于對照組(P<0.05)。實驗結(jié)果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可降低ALP活性，且隨著濃度增加ALP活性會降低更多。

圖2 A：藥物處理3 d時的ALP活性定量結(jié)果；B：藥物處理6 d時的ALP活性定量結(jié)果Fig.2 A: ALP activity quantitative results at 3 days of drug treatment; B: ALP activity quantitative results at 6 days of drug treatment注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 不同濃度INH、RFP對成骨細胞Ⅰ型膠原表達的影響

如圖3所示，細胞漿中紅色熒光隨著藥物濃度的增加，熒光越來越弱。(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他實驗組成骨細胞Ⅰ型膠原相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

圖3 不同濃度INH+RFP對成骨細胞I型膠原表達結(jié)果。A：顯微鏡下觀(100×)；B：定量結(jié)果Fig.3 Effect of different concentrations of INH+RFP on the expression of type I collagen of osteoblast. A: Microscopes (100×), B: Quantitative results注：與對照組比較， *P<0.05。

2.4 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色

如圖4及表1所示，隨著藥物濃度的增加，鈣化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和灰度越來越小。(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其他實驗

組鈣化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和灰度顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

表1 不同濃度INH+RFP對成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成能力的影響 Table 1 Effects of different concentrations of INH+RFP on the formation of calcified nodules in osteoblasts s，n=3)

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖4 A：14 d時成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果；B：顯微鏡下觀(40×)Fig.4 A: Colonization results of calcified nodules in osteoblast at 14 days; B: Microscopes (40×)

3 討論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是一種古老的疾病，在埃及木乃伊[4]和亞洲鐵器時代的遺骸[5]中通過組織學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)[6]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的證據(jù)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是一種嚴(yán)重的傳染病。由于結(jié)核菌在局部病灶內(nèi)繁殖可造成骨質(zhì)明顯的破壞并產(chǎn)生大量的壞死組織，未及時治療或治療不規(guī)范，隨著病情的進展常引起骨與關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損。骨關(guān)節(jié)結(jié)核治療目的是清除結(jié)核病灶并阻止病灶擴散，預(yù)防因骨質(zhì)破壞而出現(xiàn)的畸形及神經(jīng)功能障礙，提高患者的生活質(zhì)量。由于局部結(jié)核病灶區(qū)周圍因長期慢性炎癥刺激而產(chǎn)生大量纖維結(jié)締組織，血液循環(huán)較差，全身用藥的情況下，局部病灶很難達到有效的抗菌濃度[7]。隨著對疾病研究的不斷深入及內(nèi)固定材料的迅速發(fā)展，對局部病灶已有大量壞死組織及死骨形成的較嚴(yán)重患者，普遍認可應(yīng)盡早行病灶清除+植骨重建內(nèi)固定術(shù)[8-9]。即使進行較為徹底的病灶清除術(shù)，結(jié)核分枝桿菌也難以完全去除，故術(shù)后仍要聯(lián)合、長程、大劑量的口服抗癆藥，容易出現(xiàn)各種不良反應(yīng)，因需堅持每天服藥，病人依從性差。

近十年來，許多研究人員和臨床醫(yī)師嘗試局部用藥，以減輕全身用藥的不良發(fā)應(yīng)、提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核的治愈率。但是目前臨床上局部用藥的方式較為簡單，即病灶清除術(shù)后將抗結(jié)核藥物直接噴灑于殘腔中或噴灑于植骨表面再植入殘腔。因病灶清除術(shù)后，局部組織有大量的滲液，噴灑在病灶的抗?jié)乘幬锖芸毂粷B液和積血所稀釋，并隨滲液引流出體外，藥物在局部病灶維持時間短，治療效果有限。為了提高局部抗?jié)朝熜?，研究人員們開始關(guān)注結(jié)核藥物緩釋制劑的研究。馬學(xué)銘等[10]將利福平載藥微球與硫酸鈣/β-磷酸三鈣復(fù)合骨水泥結(jié)合制備成一種新型的復(fù)合抗結(jié)核支架材料，植入SD大鼠的肌袋模型中觀察不同時間點的局部藥物濃度以及血藥濃度，緩釋效果令人滿意，在術(shù)后第28天局部藥物濃度仍可達到殺菌濃度。Li等[11]采用3D打印技術(shù)制作圓柱型載藥(異煙肼+利福平)復(fù)合支架，將其植入新西蘭兔股骨缺損模型，觀察其體內(nèi)釋藥性能和成骨能力，異煙肼和利福平在體內(nèi)局部釋放可持續(xù)12周。骨愈合的關(guān)鍵在于成骨細胞連續(xù)不斷的增殖、分化和破骨細胞的骨吸收及胞外基質(zhì)的合成、鈣化。維持較高濃度的局部用藥可以提高抗?jié)朝熜?，但是局部高濃度的藥物是否會影響骨愈合，是值得研究和探討的。INH和RFP作為一線抗結(jié)核藥物，抗菌作用強，0.025～0.05 μg/mL的INH即可抑菌，10 μg/mL有殺菌作用，而RFP對結(jié)核桿菌的最低抑菌濃度為0.005～0.5 μg/mL，最低殺菌濃度為5 μg/mL。劉江濤等[12]用異煙肼對體外大鼠成骨細胞的毒性作用進行研究，發(fā)現(xiàn)異煙肼濃度在60 μg/mL即可抑制大鼠OB增殖，40 μg/mL時ALP活性明顯下降，20 μg/mL時I型膠原合成明顯減小。Isefuku等[13]用利福平對體外培養(yǎng)的人成骨細胞的毒性作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)利福平濃度在10 ug/mL以上時顯著抑制了OB的生長增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，INH聯(lián)合RFP在(20+6)μg/mL時抑制大鼠OB增殖及I型膠原合成，使 ALP活性及礦化能力顯著下降。因此，骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶清除術(shù)后，局部應(yīng)用INH+RFP緩釋制劑的釋放濃度應(yīng)該控制在(10+3)～(20+6)μg/mL。當(dāng)INH濃度達到10～20 μg/mL，RFP濃度達到3～6 μg/mL，兩藥聯(lián)合應(yīng)用即可協(xié)同殺滅結(jié)核菌而不影響成骨細胞活性，對細胞無毒性作用，不影響骨愈合。當(dāng)INH+RFP濃度達到(20+6) μg/mL及以上時，雖然也可以殺滅結(jié)核菌，但是對成骨細胞具有抑制作用，影響骨愈合。本研究應(yīng)用的藥物濃度與體內(nèi)持續(xù)局部抗結(jié)核治療有一定的可比性，因為病灶清除術(shù)后局部持續(xù)灌洗、注射和緩釋制劑的應(yīng)用，可以維持局部藥物濃度在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)。局部藥物濃度過高，不利于病灶清除術(shù)后骨的愈合。體外實驗為進一步體內(nèi)實驗提供理論基礎(chǔ)，應(yīng)進一步研究異煙肼聯(lián)合利福平局部用藥是否對體內(nèi)的骨修復(fù)過程有害。