● 李 靜 陳 力 王 丹 陳 燕

舌癌(carcinoma of the tongue)是口腔頜面部中最常見的惡性腫瘤之一[1]，多項(xiàng)研究證實(shí)近些年來(lái)舌癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)[2]。研究顯示，天然中草藥中的有效成分或有效部位，比如具有藥理功能的化合物或者生物堿，已成為目前抗癌研究的熱點(diǎn)。大黃素是一種蒽醌類物質(zhì)，大黃素具有抑制口腔鱗癌細(xì)胞株的增殖、并影響其細(xì)胞周期的作用[3]；蘆薈具有較高的食用和藥用價(jià)值，其中蘆薈多糖(Aloe polysaccharide，AP)是蘆薈凝膠中的主要生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種功效[4]。因此，本文擬通過(guò)對(duì)蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例，考察中藥提取物對(duì)SCC15活性的影響；同時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能促進(jìn)血管的形成，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]，是腫瘤細(xì)胞發(fā)展過(guò)程中重要的生化指標(biāo)?；诖耍疚臄M通過(guò)研究蘆薈多糖與大黃素不同配比體外干預(yù)SCC15的活性，研究對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響，初步探討其作用機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑無(wú)外泌體胎牛血清(上海宇玫博生物科技有限公司：UR50201)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：904862)；SCC15口腔癌細(xì)胞(購(gòu)自上海拜力生物有限公司)；免疫印跡抗體：山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(Biosharp公司，批號(hào)：zs-256)；β-acting(博奧森，批號(hào)：160517)；VEGF分裝單克隆抗體(北京中杉，批號(hào)：20160717)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma公司：0931)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司，批號(hào)：0331)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德)；ECL發(fā)光液(碧云天，批號(hào)：20160720)；胰酶(Biosharp公司，批號(hào)：20170530)；蘆薈多糖(江蘇瑞多生物，批號(hào)：20161124，含量70%)；大黃素(CAS：518-82-1，貨號(hào)：SF0024，陜西森弗)。

1.2主要儀器倒置顯微鏡(上海巨納科技)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)；S3006L型高壓勻質(zhì)機(jī)(Niro Soavi公司)；酶標(biāo)定量測(cè)定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；冷凍干燥機(jī)(abeonco)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)(1)細(xì)胞復(fù)蘇：SCC15人舌鱗狀癌細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物有限公司，將細(xì)胞從液氮灌中取出，迅速投入37℃超純水中解凍，轉(zhuǎn)移至離心管中，加4mL DMEM高糖培養(yǎng)基，離心1500 r/min×2min，棄去上清，加入5mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，用巴士吸管輕輕吹打，將細(xì)胞吹散均呈懸浮狀態(tài)，再將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。(2)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底80%以上時(shí)，加入1mL 0.25%的胰酶消化(約1min)，然后4mL加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，離心1500 r/min×2min，收集細(xì)胞，再加入適量完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)輕輕吹打至懸浮，分別傳代至2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)孵育；傳3代待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后便可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞鑒定取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行消化，離心后接種于無(wú)菌的蓋玻片上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿至玻片的50%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍后，分別加入丙酮、甲醇各1mL，室溫固定30min，棄上清，以PBS清洗3次，再加入3%H2O2去離子水室溫孵育10min，棄上清，以PBS清洗3次，加入封閉用山羊血清在室溫下繼續(xù)孵育30min，再滴加c-kit一抗(1∶200)適量，將封閉后的玻片置于冰箱冷藏過(guò)夜，取出后再滴加山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(1∶100)，置二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min后，在避光條件下置于電子顯微鏡下觀察[6]。

1.5 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖[7]取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后稀釋并將細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白組、陽(yáng)性組、蘆薈多糖高、中、低劑量組，每組6個(gè)復(fù)孔。根據(jù)《藥典》中成人最大劑量/人血漿容積(4000mL)換算蘆薈多糖的最大劑量為0.225μg/mL、大黃素的最大劑量為0.056μg/mL?？瞻捉M：SCC15給予不含藥DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h；給藥組：給藥劑量及比例見表1。

表1 不同配伍比例給藥劑量

各給藥組的SCC15口腔癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別根據(jù)給予含蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例的DMEM完全培養(yǎng)液，以上各組藥物干預(yù)后培養(yǎng)24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的 MTT溶液，在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置4h后，棄上清，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，于搖床上振蕩10 min，酶標(biāo)儀中設(shè)定490 nm波長(zhǎng)處讀取各組的OD值，計(jì)算均值、比較各組細(xì)胞的增殖情況。

1.6 Western-blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)[8]藥物干預(yù)后收集各組細(xì)胞，分別加入100 uL裂解液(Tris pH=7.5，1 mM EDTA中，50 mM NaCl，0.5%Triton-X-100)，振搖，并將溫度保持為4℃，持續(xù)30min，裂解后再將各組細(xì)胞以5000 r/min×10 min離心，收集上清液，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，根據(jù)考馬斯亮蘭試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞裂解后的蛋白濃度；樣品中加入上樣緩沖液稀釋，并煮沸5min使蛋白變性，備用。SDS-PAGE凝膠上樣量50 μL，在150 V的穩(wěn)壓電場(chǎng)中電泳約90min，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素濾膜(電流為380 mA)，最終加入脫脂奶粉封閉，室溫下過(guò)夜，剪膜，根據(jù)分子量分開后分別以加1∶500稀釋的一抗(VEGF)及內(nèi)參抗體(β-acting，1∶2000)室溫孵育2 h，HRP標(biāo)記二抗(1∶1000)孵育1 h后，洗膜，ECL發(fā)光液發(fā)光后X光片曝光，掃描記錄結(jié)果，Gel-analyze 分析軟件分析條帶灰度，進(jìn)行半定量比較分析，以IOD值表示蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 c-kit免疫熒光鑒定和細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞貼壁后，逐漸伸展，細(xì)胞密度低時(shí)排列疏松，形態(tài)特征明顯，呈長(zhǎng)條形或不規(guī)則形態(tài)，生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)后，細(xì)胞增殖加快，體積變大且排列緊密，呈放射狀(圖1)；免疫染色后，胞體和突起明顯著色，與鄰近細(xì)胞相互連接成網(wǎng)狀(圖2)。圖片均在100倍鏡下觀察并拍照。

圖1 (空白組×100)

圖2 (c-kit免疫染色×100)

2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況與空白組比較，蘆薈多糖單劑量組、大黃素單劑量組、各配伍組的細(xì)胞活性均顯著降低(P<0.05)，且隨大黃素比例的增加抑制作用而增強(qiáng)，其中以蘆薈多糖與大黃素配伍1∶2組、2∶3、1∶3組最為顯著(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各組對(duì)SCC15口腔癌細(xì)胞增殖的影響

注： 與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 VEGF蛋白表達(dá)的變化結(jié)果顯示，空白組VEGF蛋白的表達(dá)較高，各給藥組VEGF蛋白表達(dá)降低，其中蘆薈多糖配大黃素1∶2、2∶3、1∶3組VEGF蛋白的表達(dá)顯著減弱，且當(dāng)比例為1∶3時(shí)，VEGF蛋白的表達(dá)最低。說(shuō)明：在本次實(shí)驗(yàn)中，VEGF在SCC15口腔癌細(xì)胞中具有較高表達(dá)，大黃素與蘆薈多糖配伍對(duì)VEGF蛋白的表達(dá)有顯著抑制作用，且以1∶3的比例效果最顯著。結(jié)果如表3、圖3所示。

表3 VEGF/內(nèi)參(IOD比值)的情況

注： 與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 各組VEGF蛋白的表達(dá)

(A代表空白組；B表示蘆薈多糖單劑量組；C表示大黃素單劑量組；D表示蘆薈多糖配伍大黃素1∶2組；E表示配伍2∶3組；F表示配伍1∶3組)

3 討論

舌癌多數(shù)為鱗癌，惡性程度高，生長(zhǎng)快，浸潤(rùn)性強(qiáng)，此外舌體還具有豐富的淋巴及血運(yùn)循環(huán)，加之其頻繁的機(jī)械運(yùn)動(dòng)，使得舌癌極易在發(fā)病的早期出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為舌癌歸屬于中醫(yī)“舌疳”與“舌菌”范疇，發(fā)病病因主要是外感六淫，內(nèi)傷七情，入里化火，火性炎上，舌上便生潰瘍，加之吸煙，火毒熏烤，或陰虛火自內(nèi)生，迫使火毒淤結(jié)，從而致生舌癌[10]。目前舌癌治療中醫(yī)治療方法初期主要清熱解毒，清瀉心火，行氣化癖，除濕化濁，后期主扶正祛邪，攻補(bǔ)兼施，治宜補(bǔ)益心脾，清熱解毒之法[11]。而西醫(yī)方法主導(dǎo)的是以手術(shù)為主的綜合序列治療，雖然近些年來(lái)舌癌的手術(shù)切除率已明顯提高，手術(shù)患者的病死率明顯下降，但其局部、區(qū)域性復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然較高[12]，因此，尋找出毒副作用低且對(duì)腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。蘆薈多糖(Aloe polysaccharide，AP)是蘆薈凝膠部分除去水分以外的主要成分，AP作為藥用品種蘆薈的主要活性物質(zhì)之一，其抗腫瘤作用備受關(guān)注[13]。有研究顯示，蘆薈多糖對(duì)S180、H22荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用，延長(zhǎng)小鼠生存期[14]。大黃素是一種蒽醌類物質(zhì)，最新研究顯示，大黃素能夠抑制小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤以及大鼠瓦克瘤，抑制率大于30%[15]。此外大黃素具有抑制口腔鱗癌細(xì)胞株的增殖并影響其細(xì)胞周期的作用。因此，本文擬通過(guò)體外培養(yǎng)SCC15細(xì)胞，觀察蘆薈多糖與大黃素不同配伍比例對(duì)其是否具有抑制作用及部分作用機(jī)制。

VEGF通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR2受體激活下游信號(hào)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和管狀形成，促進(jìn)新生血管形成、提高血管通透性，滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)的需求，因此，阻斷VEGF-VEGFR2信號(hào)通路抑制血管異常增生是腫瘤靶向治療的重要策略[12]。本研究中，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖、大黃素單劑量組及其不同比例的配伍組對(duì)體外培養(yǎng)的SCC15細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且細(xì)胞活性隨隨大黃素比例的增加而逐漸降低。根據(jù)細(xì)胞活性中的結(jié)果，將空白組、蘆薈多糖與大黃素單劑量組、蘆薈多糖配大黃素1∶2、2∶3組通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示：腫瘤細(xì)胞SCC15中對(duì)VEGF具有高表達(dá)，給予藥物干預(yù)后，各單劑量組及配伍組均能抑制VEGF的表達(dá)，其中以蘆薈多糖配大黃素1∶3組尤為顯著，說(shuō)明蘆薈多糖與大黃素配伍可能通過(guò)下調(diào)VEGF蛋白的高表達(dá)從而抑制SCC15細(xì)胞的增殖能力，在體外蘆薈多糖與大黃素以1∶3的比例干預(yù)，具有較好的抗腫瘤作用。

綜上所述，蘆薈多糖與大黃素配伍能降低SCC15細(xì)胞VEGF蛋白的高表達(dá)，從而達(dá)到抗瘤作用，但本研究?jī)H研究了部分機(jī)制且為體外研究，下一步可選擇觀察含藥血清對(duì)SCC15細(xì)胞的抑制作用或口服湯劑對(duì)在體荷瘤小鼠的治療作用，其作用通路及相關(guān)基因蛋白還有待進(jìn)一步研究。