羅月芳 唐婕妤 彭菲 譚朝陽

摘要：目的 ?建立益母草懸浮細胞系，并對其轉化生成熊果苷的條件進行優(yōu)化。方法 ?以前期實驗優(yōu)選出的愈傷組織為材料建立懸浮細胞系，加入氫醌并培養(yǎng)一段時間后，測定胞內與胞外熊果苷產量，計算轉化率。結果 ?建立的益母草懸浮細胞系分散性良好，通過生長曲線的測定，確定加入氫醌的最佳時期為接種培養(yǎng)的第6日;通過對不同濃度氫醌、不同轉化時間的研究，結合熊果苷產生的動力學研究，優(yōu)選出加入3 mmol/L氫醌轉化12 h的熊果苷總產量及胞內產量最高，氫醌轉化率也較高。結論 ?益母草懸浮細胞生長速度快，轉化氫醌生成熊果苷的能力較強，有望開發(fā)成為新的生物轉化體系。

關鍵詞：益母草;懸浮細胞;轉化;氫醌;熊果苷

中圖分類號：R284.2 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0080-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.017

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Abstract： Objective To establish the suspension cell lines of Leonurus japonicus and optimize the conditions for conversion of hydroquinone to arbutin. Methods The suspension cell lines were established based on the callus optimized in the previous study. After hydroquinone was added to it and cultured for a period of time， the intracellular and extracellular arbutin production were determined and the conversion rate was calculated. Results Well distributed suspension cell lines were established. Through the measurement of growth curve， it was determined that the best period for adding hydroquinone was the sixth day of inoculation culture. By studying the different concentrations of hydroquinone and different transformation time， combined with the kinetics of arbutin production， it was preferred to add 3 mmol/L hydroquinone for 12 h， the total arbutin yield and intracellular yield were the highest， and hydroquinone conversion rate was high. Conclusion With the fast growth rate and strong conversion ability， the suspension cell lines of Leonurus japonicus is expected to develop into a new biotransformation system.

Keywords： Leonurus japonicus; suspension cells; transformation; hydroquinone; arbutin

熊果苷又名熊果素，是一種天然存在的糖苷類物質，具有美白、抗?jié)?sup>[1]、抗腫瘤^[2]、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘^[3]等作用，因而應用廣泛。從植物中提取熊果苷存在技術復雜、效率低、資源依賴性強等問題，比較而言，用植物組織培養(yǎng)方法獲得熊果苷更為高效。如彭飛宇^[4]研究表明，通過黃芩毛狀根將氫醌合成熊果苷的轉化率高達55.6%;彭春秀等^[5]利用白花曼陀羅懸浮培養(yǎng)細胞糖基化外源氫醌合成熊果苷，約有93.4%的氫醌轉化合成了熊果苷。

益母草Leonurus japonicus Houtt.為藥用草本植物，本課題組在前期研究中已篩選出可用于轉化氫醌生成熊果苷的優(yōu)良愈傷組織^[6]，但愈傷組織不能準確控制接種量，轉化效率低，不適合擴大規(guī)模的生物反應器培養(yǎng)。因此，本研究利用該愈傷組織建立懸浮細胞系，并進一步優(yōu)化轉化反應條件，對氫醌轉化生成熊果苷的動力學進行研究。

1? 儀器與試藥

Breeze2高效液相色譜儀，美國Waters公司;GZX-450E光照培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-2D雙人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;電子精密天平，格特勒-托利多儀器（上海）有限公司;TS-2012GZ光照恒溫培養(yǎng)搖床，金壇市精達儀器制造有限公司。

熊果苷對照品（批號111951-201301，含量99.6%），中國食品藥品檢定研究院;氫醌（批號201006131，含量99.0%），四川西亞化工股份有限公司。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為去離子水。所用材料為湖南中醫(yī)藥大學生物工程實驗室前期誘導與篩選出的益母草疏松愈傷組織。

2? 方法與結果

2.1? 益母草懸浮細胞系的建立

取5 g生長旺盛的疏松愈傷組織，接入含100 mL培養(yǎng)液（MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+2.0 mg/L 6-芐基嘌呤）的250 mL搖瓶中，轉速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。按新舊液比為3∶1每隔5 d換液。培養(yǎng)前期每次換液時剔除大的細胞團，待培養(yǎng)至有充分的較小細胞團后，換液時將懸浮細胞液過50目篩，收集濾液，靜置片刻待細胞下沉，按新舊液比為3∶1棄去上液并補足新液，繼續(xù)搖床培養(yǎng)。多次重復，培養(yǎng)一段時間后，建立起益母草懸浮細胞系。此后間歇過50目篩，以維持懸浮細胞的分散性。

在初期懸浮培養(yǎng)中，細胞團塊較大，細胞團容易沉淀，靜置2 min，懸浮液即清澈透明，換液時棄去大的細胞團。培養(yǎng)一段時間后，靜置2 min，大細胞團雖下沉，但懸浮液不清透，有較多小細胞團懸浮其中。延長靜置時間，從培養(yǎng)瓶底部向上觀察，可見白色的小細胞團。將細胞過50目篩后，由于生物量驟減，細胞生長緩慢。隨著培養(yǎng)時間的延長，生物量迅速增加。顯微觀察可見，細胞團較小，分散度、均一性較好。

2.2? 益母草懸浮細胞系生長曲線測定

將益母草懸浮細胞種子液以5 g/100 mL培養(yǎng)液接種至250 mL搖瓶。轉速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。采用分批培養(yǎng)方式，中途不換液，每日收獲3瓶搖瓶，將各瓶懸浮細胞培養(yǎng)液混合于抽濾瓶中，抽濾分離細胞與培養(yǎng)液，測定培養(yǎng)液pH值和懸浮細胞濕重;將收獲的懸浮細胞以60 ℃烘干至恒重，測定其干重。

益母草懸浮細胞生長曲線。細胞量的增長情況呈“S”形曲線，延遲期較短;接種后第3日進入對數(shù)生長期，細胞分裂活躍，數(shù)目迅速增加;第8日進入平臺期，生長趨于平緩;第13日后，培養(yǎng)瓶內某些營養(yǎng)物質已耗盡，有毒代謝產物累積，細胞生長逐漸進入衰亡期，生長曲線開始下降。懸浮培養(yǎng)液配制時pH值調節(jié)為5.8，滅菌后為5.4。在培養(yǎng)過程中，pH值隨培養(yǎng)時間延長和細胞生物量的增加逐漸增大，這可能與益母草次生代謝生成相關生物堿有關，但pH值變化較平緩，最大時僅為5.99，不會影響細胞生長，無需調控。

在分批培養(yǎng)中，第8日進入平臺期時，益母草懸浮細胞干重達1.5 g/瓶，為初始生物量（0.3 g/瓶）4倍以上;細胞濕重達32 g/瓶，達初始生物量的6倍。

綜上，考慮細胞活力和細胞生物量兩方面因素，益母草懸浮細胞培養(yǎng)可選擇在接種后第6～8日（接種當日記為第0日）繼代或做轉化實驗。

2.3? 熊果苷含量檢測

2.3.1? 供試品溶液的制備

將收獲的3瓶懸浮細胞培養(yǎng)液混合，抽濾，細胞殘渣用水清洗3遍，和濾液一起置-80 ℃保存。測定時取出解凍，細胞殘渣加10倍量70%甲醇，于80 ℃回流1 h，冷卻后補足減失的質量，過0.45 ?m濾膜;培養(yǎng)液即濾液直接解凍后過0.45 ?m濾膜，即得。

2.3.2? 對照品溶液的制備

取熊果苷、氫醌對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL含0.05 mg的混合溶液，即得。

2.3.3? 色譜條件

采用Ultimate XB-C18（HS）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（5∶95），檢測波長285 nm，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，柱溫30 ℃。

2.4? 不同濃度氫醌和轉化時間對益母草懸浮細胞生成熊果苷的影響

以5 g/100 mL接入益母草懸浮細胞種子液，轉速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。接種后第6日上午同時添加1、3、6 mmol/L氫醌，于12、24、48 h后分批取樣，按“2.3”項下方法檢測，并計算熊果苷轉化率。熊果苷轉化率（%）=（轉化后培養(yǎng)物中所含熊果苷摩爾數(shù)+培養(yǎng)液中熊果苷摩爾數(shù)）÷加入培養(yǎng)體系中的氫醌總摩爾數(shù)×100%。

相同濃度條件下，隨著轉化時間的延長，熊果苷在胞內產量逐漸減少，胞外產量增加;1 mmol/L氫醌轉化24 h時轉化率最高，6 mmol/L氫醌轉化48 h時總產量最高。

相同轉化時間，隨氫醌濃度增加，熊果苷胞外含量明顯增大，轉化率明顯降低;熊果苷總產量隨氫醌量增加和轉化率降低雙重影響而波動，1 mmol/L氫醌轉化24 h時轉化率最高，達56.32%;6 mmol/L氫醌組轉化48 h熊果苷總產量最高，達64.49 mg，但轉化率只有13.16%。

2.5? 益母草懸浮細胞生成熊果苷的動力學研究

以5 g/100 mL接入益母草懸浮細胞種子液，轉速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培養(yǎng)。接種后第6日上午同時添加終濃度2 mmol/L氫醌，搖瓶全避光處理，分批于不同時間取樣，按“2.3”項下方法檢測熊果苷含量?？梢姡砑託漉? h，即可在細胞內檢測到熊果苷;3 h時，培養(yǎng)液中能檢測到微量熊果苷;6 h時，胞內熊果苷產量最高，之后持續(xù)下降;36 h時，胞內熊果苷產量已基本降到最低值，而胞外產量達到峰值，但此時胞內熊果苷產量并非為0，96 h時仍有部分細胞有活性。

3? 討論

本研究以前期篩選出的疏松愈傷組織為材料建立了益母草懸浮細胞系。懸浮培養(yǎng)第3日進入對數(shù)生長期，第8日進入平臺期，此時益母草懸浮細胞干重和濕重較初始生物量分別增加了4、6倍，與姜新超^[7]報道百合懸浮細胞增殖結果類似。結果表明，已建立的分散均勻、細胞團顆粒小的懸浮系在旺盛生長期可繼代或作為種子液進行擴增培養(yǎng)，以進行下一步的轉化實驗。

在不同氫醌濃度和轉化時間研究中，總體來說，轉化時間延長或氫醌濃度增大都會導致熊果苷胞內產量減少、胞外產量增多;氫醌濃度越低，轉化率越高，利用度越充分;氫醌濃度越高，熊果苷產出量越多，但轉化率下降。綜合考慮熊果苷轉化率、產量、提取分離成本，認為在3 mmol/L氫醌濃度轉化12 h時收獲最好，此時熊果苷基本在胞內，熊果苷總產量為58.63 mg，且氫醌轉化率較高。胞內濃度高，有利于后期提取分離。

在益母草懸浮細胞轉化的動力學研究中，熊果苷總產量在轉化6 h時達到峰值，隨后以24 h為周期出現(xiàn)波動。由于自添加氫醌起，搖瓶處于全避光狀態(tài)培養(yǎng)，可以排除光照改變導致熊果苷產量波動。隨著轉化時間的延長，收獲的細胞鮮重減少，培養(yǎng)液體積增多，說明細胞受氫醌毒性死亡，胞液釋放，故細胞鮮重持續(xù)減少，培養(yǎng)液體積持續(xù)增多。推測益母草懸浮細胞在添加氫醌前一直處于光暗交替下培養(yǎng)，帶有一定的生理周期，所以在轉化合成熊果苷時呈現(xiàn)周期性波動，且外界周期自夜間至晨間時熊果苷產出量高。

綜上，隨著轉化時間延長或氫醌濃度增大，熊果苷以在胞內為主逐漸轉變成以胞外為主，最終全部轉到胞外;胞內與胞外含量呈明顯的消長關聯(lián)性。結合動力學研究分析其原因，氫醌對細胞有一定毒性，隨濃度的提高和時間的延長，導致細胞內溶酶體釋放，細胞出現(xiàn)自溶，胞外熊果苷是細胞大量解體將胞內熊果苷釋放到胞外的結果。

植物懸浮細胞生物轉化的動力學研究迄今少有報道。本研究結果可為其他生物轉化研究提供借鑒。利用益母草懸浮細胞系通過生物轉化得到熊果苷，可豐富熊果苷的來源途徑。

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