程立君 彭佳華 胡志芳 高文 茶勇

摘? 要：采用苯酚—硫酸法對(duì)昭通天麻多糖含量測(cè)定，結(jié)果顯示：在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在濃度0～0.0175mg/mL線性關(guān)系良好，建立回歸方程y=79.186x+0.0005（r=0.9990）;經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率以及重現(xiàn)性等實(shí)驗(yàn)證明，該方法可用于天麻多糖含量的測(cè)定。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究昭通天麻多糖的超聲提取條件，并采用苯酚—硫酸法對(duì)多糖含量進(jìn)行測(cè)定，超聲輔助提取的最佳提取條件組合為：提取溫度45℃，提取時(shí)間55min，料液比1∶35（g/mL）。

關(guān)鍵詞：天麻;多糖;苯酚—硫酸法

中圖分類號(hào) S567.39文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）（02-03）-0028-03

Abstract：Phenol-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharides in Gastrodia elata.The results showed that the absorbance at 490nm wavelength had a good linear relationship between the concentration of 0～0.0175mg/mL.The regression equation was established（y=79.186x+0.0005，r=0.9990）.The results of precision，stability，recovery rate and reproducibility experiments showed that the method could be used determination of polysaccharide content in Gastrodia elata.The extraction conditions of Polysaccharides from Gastrodia elata in Zhaotong were studied by orthogonal experiment.The content of polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction temperature 45℃，extraction time 55 min，solid-liquid ratio 1：35 （g/mL）.

Key words：Gastrodia elata;Polysaccharide;Phenol-sulfuric acid method

天麻（Gastrodia elata Blume）屬蘭科多年生共生草本植物，為名貴的傳統(tǒng)中藥，至今已有近3000年的臨床應(yīng)用歷史。天麻含有天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛、香草醛、香草醇、派立辛、天麻多糖、多種氨基酸等有效成分，現(xiàn)代研究表明天麻具有鎮(zhèn)靜、催眠，抗驚厥，提高機(jī)體免疫力，改善記憶力等藥理作用[1]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多糖被認(rèn)為是一類重要的信息分子。天麻多糖還具有抗氧化[2，3]、延緩細(xì)胞衰老[4]、減輕視網(wǎng)膜損傷、保護(hù)視網(wǎng)膜[5]、降血壓[6]、保肝[7，8]、抗腫瘤[9]等方面作用，因其毒副作用小、安全性強(qiáng)、功能多等特點(diǎn)而被越來(lái)越多的人所關(guān)注。

昭通是天麻主要產(chǎn)區(qū)之一，自然條件得天獨(dú)厚，所產(chǎn)天麻質(zhì)量上乘，享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。筆者采用苯酚-硫酸法測(cè)定昭通天麻多糖的含量，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選天麻多糖的最佳提取條件，為昭通天麻的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 供試鮮天麻從昭通小草壩天麻種植田間采集。苯酚（國(guó)藥滬試），無(wú)水葡萄糖，無(wú)水乙醇，濃硫酸（南京化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 UV759型紫外-可見光分光光度計(jì)（上海奧普勒儀器有限公司）;AX224ZH型電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）;0412-1型離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;HWS-28型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;SK5200LHC 超聲波洗滌器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天麻預(yù)處理 鮮天麻采樣后立即回實(shí)驗(yàn)室洗凈，蒸透，切片后55℃烘干，粉碎后過(guò)60目篩。取過(guò)篩的天麻干粉5g，按料液比1∶30加入80%乙醇，超聲浸提，除去天麻中的單糖、低聚糖、脂類、色素等成分，過(guò)濾后晾干、粉碎成天麻粉末備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取烘干至衡重的葡萄糖0.01g，加去離子水溶解后定容至100mL，配制成濃度為0.1mg/mL的對(duì)照品溶液待用。稱取5g苯酚加水定容至100mL，配制成濃度為5%的苯酚溶液待用。取8支具塞試管，分別準(zhǔn)確量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL至試管，并加水至溶液體積為2.0mL。在試管內(nèi)分別加入1mL5%的苯酚溶液和5mL的濃硫酸，靜置10min后，放入沸水中水浴反應(yīng)15min，取出冷卻至室溫。以加葡萄糖對(duì)照品溶液0.0mL的空白溶液作參比，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)量吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 天麻含量的測(cè)定方法 參照王韜[10]的方法并進(jìn)行了修改。精確稱取1g預(yù)處理過(guò)的天麻粉樣品至錐形瓶中，按料液比1∶25加去離子水，35℃超聲提取20min，將溶液定容至100mL后過(guò)濾，取濾液10mL定容至100mL作為供試樣品溶液，參照1.3.2的方法測(cè)吸光度值，并按式（1）計(jì)算天麻多糖含量。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用超聲輔助提取工藝提取昭通天麻多糖，為綜合考慮各因素對(duì)天麻多糖含量的影響，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)考查因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)（見表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同體積的對(duì)照品溶液在490nm處測(cè)得的吸光度值見表2，以葡萄糖對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=79.186x+0.0005（r=0.9990），表明該方程可用于昭通天麻多糖的含量測(cè)定。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取0.5mL天麻多糖供試樣品溶液，按1.3.2的方法連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)得天麻多糖溶液在490nm處吸光度值見表3，結(jié)果RSD=2.56%（n=5），表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取天麻多糖供試樣品溶液0.5mL，按照1.3.2的方法，每隔0.5h測(cè)1次吸光度值，結(jié)果見表4，表明反應(yīng)2.5h內(nèi)溶液顯色穩(wěn)定。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取5支具塞試管，分別加入0.5mL天麻多糖供試溶液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對(duì)照品溶液，補(bǔ)水至2mL，參照1.3.2的方法計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。由表5可知，平均加樣回收率為100.50%，RSD為1.78%，表明本方法準(zhǔn)確度較好，能測(cè)定天麻多糖的含量。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定 為考察測(cè)定方法的可靠性特設(shè)計(jì)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，稱取同一批次的天麻粉參照1.3.2和1.3.3的方法進(jìn)行處理，結(jié)果見表6，結(jié)果RSD=2.96%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 天麻多糖超聲提取條件的優(yōu)化 由表7可知，在超聲輔助提取天麻多糖的過(guò)程中，提取溫度對(duì)天麻多糖的提取率影響最大（R=12.46），其次為料液比，提取時(shí)間的影響最小。最優(yōu)提取工藝為：提取溫度45℃，提取時(shí)間55min，料液比1∶35（g/mL）。

3 結(jié)論與討論

苯酚-硫酸法測(cè)定天麻多糖含量結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性強(qiáng)、操作方便，用于天麻多糖含量測(cè)定較為適合。在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度的回歸方程為y=79.186x+0.0005（r=0.9990）。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲輔助提取的最佳提取條件組合為：提取溫度45℃，提取時(shí)間55min，料液比1∶35（g/mL）。

目前天麻在全國(guó)多個(gè)地區(qū)廣泛種植，研究資料表明各地天麻的多糖差異較大，德江天麻多糖提取率最高達(dá)39.93%[11]，西藏天麻多糖提取率最高達(dá)33%[12]，陜西天麻多糖提取率最高達(dá)32.98%[13]，而本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示昭通天麻多糖提取率最高達(dá)42.29%。不同提取方法和測(cè)定方法對(duì)天麻多糖含量結(jié)果也有差異[10，14，15]，因此有必要建立統(tǒng)一的多糖檢測(cè)方法和完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。同時(shí)天麻多糖含量高低與天麻品質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系也有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)編：徐世紅）