鄭 巧，張 琪

0引言

共焦顯微鏡(confocal microscopy, CM)檢查作為一種“活體組織學(xué)檢查”方法，以其實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、快速、高清的特點(diǎn)，已在眼科臨床及科研中得到廣泛應(yīng)用。其放大倍率可達(dá)800倍，分辨率可達(dá)1μm，能夠從細(xì)胞水平對(duì)活體角膜組織進(jìn)行觀察，在角膜生理、病理研究及疾病診斷、病情評(píng)估、隨訪等方面顯示出優(yōu)越性。

1共焦顯微鏡在感染性角膜疾病中的應(yīng)用

1.1真菌性角膜炎真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)近年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其病程遷延，是導(dǎo)致角膜盲的常見(jiàn)原因，早期診斷并啟動(dòng)有效的抗真菌治療是改善其預(yù)后的重要因素。角膜刮片鏡檢及培養(yǎng)是FK診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢，其培養(yǎng)可能需數(shù)周，且敏感性低，陽(yáng)性率不到50%[1]。角膜組織病理學(xué)檢查及PCR技術(shù)已用于診斷FK，但限于其侵入性，難以早期實(shí)施。CM可無(wú)創(chuàng)、快速的檢測(cè)角膜中的真菌。CM下真菌菌絲多呈高反光的線型結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)分節(jié)或分支，呈竹節(jié)狀或樹枝狀，叢狀雜亂排列。鐮刀菌屬分支夾角多為90°，曲霉菌屬多為45°，據(jù)此可做出初步鑒別。孫曉會(huì)等[2]對(duì)比分析了CM與角膜刮片鏡檢在FK診斷中的作用，發(fā)現(xiàn)CM有更高的陽(yáng)性診斷率，觀察到的菌絲和孢子與角膜刮片檢查所見(jiàn)相似，對(duì)于病程較長(zhǎng)，已使用抗真菌藥物或已行病灶刮除等治療的患者，兩者診斷敏感度均下降。有學(xué)者就檢查者經(jīng)驗(yàn)在CM診斷FK中的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)有經(jīng)驗(yàn)的檢查者診斷的平均敏感度為71%，缺乏經(jīng)驗(yàn)的檢查者為43%，所有檢查者診斷的特異性為75%或更高，顯示檢查者經(jīng)驗(yàn)在CM的診斷準(zhǔn)確性中扮演重要角色。目前，CM的分辨率還不能滿足對(duì)真菌微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，無(wú)法準(zhǔn)確鑒別菌種。近期Chidambaram等[3]使用CM觀察不同病原體所致FK的角膜細(xì)胞變化，發(fā)現(xiàn)前基質(zhì)星狀細(xì)胞與鐮刀菌性角膜炎相關(guān)，樹突狀細(xì)胞與曲霉菌性角膜炎相關(guān)，提示角膜細(xì)胞的反應(yīng)可能具有一定特異性，為菌種鑒別提供線索。

1.2棘阿米巴性角膜炎棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis, AK)由棘阿米巴原蟲感染所致，較真菌性角膜炎、細(xì)菌性角膜炎等少見(jiàn)，近年隱形眼鏡使用的增加使其發(fā)病率明顯上升，隨地區(qū)不同，每10000名隱形眼鏡配戴者有0.01～1.5名感染棘阿米巴原蟲[4-5]。由于早期臨床表現(xiàn)缺乏特征性，AK常被誤診為單純皰疹病毒性角膜炎、細(xì)菌性角膜炎或真菌性角膜炎[6-7]。據(jù)報(bào)道，在培養(yǎng)物中分離出棘阿米巴的概率為0～68%[8]。棘阿米巴有滋養(yǎng)體和包囊兩種形態(tài)，體積均較大(>10μm),在CM下呈圓形或卵圓形、高反光，易于檢出。1992年Chew等[9]首次報(bào)道通過(guò)CM診斷AK。此后許多研究者研究并肯定了CM對(duì)AK的診斷意義，但報(bào)道的診斷靈敏度、特異性不一。王玉亭[10]回顧分析了58例AK，發(fā)現(xiàn)CM的檢出率為86.4%，其中32例根據(jù)CM確定的感染范圍切除病灶，實(shí)施角膜移植術(shù)，取得滿意效果。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，棘阿米巴包囊可長(zhǎng)期存留于角膜組織中，最長(zhǎng)達(dá)31mo，角膜炎癥控制后仍需藥物治療3～4mo[11]。感染后期角膜上皮愈合，此時(shí)可利用CM隨訪觀察，指導(dǎo)治療?，F(xiàn)有研究對(duì)棘阿米巴在CM下的表現(xiàn)描述各異。近期Craene等[12]首次參照PCR對(duì)CM診斷AK的價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估并研究了其診斷標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為4種影像與AK顯著相關(guān)：亮點(diǎn)(沒(méi)有雙壁結(jié)構(gòu)的圓形或卵形高反射物)，目標(biāo)圖像(具有低反射光暈的高反射物)，滋養(yǎng)體樣圖像(直徑>30μm，表面呈棘狀突起的高反射物)和高反射物體簇。其中目標(biāo)圖像和滋養(yǎng)體樣圖像診斷特異性最高，為100%，但敏感性最低，分別為8.7%和10.9%，因此需要尋找多方面證據(jù)確定診斷。Chidambaram等[3]發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)體樣圖像可形成簇，尤其在局部類固醇治療后的病例。Zhang等[13]對(duì)29例AK進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體樣圖像的線性或成簇排列與預(yù)后不良相關(guān)。另有研究者在病程較長(zhǎng)的AK中觀察到滋養(yǎng)體樣圖像簇狀排列，且比例很高，這些患者曾使用局部類固醇治療[14]。滋養(yǎng)體樣圖像的簇狀排列是否是AK有用的預(yù)后指標(biāo)還需要更大量的研究確定。這些研究提示，CM可能提供診斷以外的更多信息。

1.3病毒性角膜炎單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的感染致盲原因[15]。原發(fā)性角膜感染后，單純皰疹病毒進(jìn)入三叉神經(jīng)節(jié)，終生潛伏并周期性激活，引起復(fù)發(fā)性HSK[16]。其嚴(yán)重并發(fā)癥之一是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病變[17]。CM雖然無(wú)法分辨病毒，但可用于HSK的病理研究。Müller等[18]使用CM觀察HSK后角膜瘢痕形成眼及對(duì)側(cè)臨床未受累眼，發(fā)現(xiàn)瘢痕眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度、總神經(jīng)長(zhǎng)度顯著低于健康對(duì)照組，對(duì)側(cè)眼亦相應(yīng)降低，兩者角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度與總神經(jīng)長(zhǎng)度、角膜知覺(jué)呈正相關(guān)，推測(cè)單側(cè)HSK后，雙側(cè)角膜神經(jīng)受損，神經(jīng)肽水平降低，內(nèi)皮細(xì)胞損失。

2共焦顯微鏡在變性性角膜疾病中的應(yīng)用

2.1角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜營(yíng)養(yǎng)不良包括一大類與家族遺傳有關(guān)的原發(fā)性進(jìn)行性角膜疾病，以角膜異常物質(zhì)沉積為共同特征，表現(xiàn)各異，根據(jù)主要受累層次分為上皮和上皮下?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良、上皮-基質(zhì)TGFBI營(yíng)養(yǎng)不良、基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良四類。CM是觀察CD組織特征的有用工具。Meesmann角膜營(yíng)養(yǎng)不良主要累及上皮層，表現(xiàn)為上皮囊泡樣病變，囊泡突起或破裂后引起眼部不適，可被誤診為干眼。CM下其上皮細(xì)胞間存在多量圓形或卵圓形囊泡，大小不一，邊界清晰，多呈高反光，內(nèi)部可含高反光結(jié)構(gòu)，亦可見(jiàn)單獨(dú)的高反光結(jié)構(gòu)散在于細(xì)胞間，在病變區(qū)域與正常區(qū)域間可見(jiàn)明顯的分界[19]。顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良屬上皮-基質(zhì)TGFBI營(yíng)養(yǎng)不良一類，表現(xiàn)為Bowman 膜下及淺基質(zhì)層內(nèi)白色顆粒狀物質(zhì)沉著，逐漸融合成片，形成盤狀、雪花狀等外觀[20]。CM下可見(jiàn)Bowman 膜不規(guī)則增厚，反光增強(qiáng)，基質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)大片高反光，其間可見(jiàn)短棒狀強(qiáng)反光結(jié)構(gòu)。Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良(Fuchs’ endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)是較常見(jiàn)的一種CD，相關(guān)研究較多。遺傳突變和環(huán)境觸發(fā)因素如氧化應(yīng)激等引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，異常膠原沉積，后彈力膜增厚，滴狀贅疣形成，最終導(dǎo)致角膜水腫和視力下降[21-22]。利用CM對(duì)FECD進(jìn)行分級(jí)，與臨床主觀分級(jí)有很好的相關(guān)性，CM可作為FECD研究的有用工具[23]。FECD患者角膜基底膜下神經(jīng)形態(tài)異常，敏感性下降。幾項(xiàng)研究顯示晚期FECD角膜神經(jīng)減少或缺失，認(rèn)為其歸因于角膜水腫[23-24]。 Aggarwal等[25]通過(guò)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ECD大多數(shù)神經(jīng)改變已經(jīng)存在于早期，伴有樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)顯著增加，顯示免疫激活和神經(jīng)缺失可能參與FECD的發(fā)病機(jī)制。研究表明，F(xiàn)ECD前角膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞在早期出現(xiàn)異常，這解釋了為什么角膜后彈力層剝除聯(lián)合深板層內(nèi)皮移植術(shù)(descemet’s stripping endothelial keratoplasty, DSEK)后角膜結(jié)構(gòu)和光學(xué)功能不能恢復(fù)正常[26]。隨著技術(shù)進(jìn)步，更精準(zhǔn)的DSEK帶來(lái)更好的預(yù)后，此時(shí)宿主角膜早期的亞臨床變化與術(shù)后視覺(jué)結(jié)果更加相關(guān)。Amin等[27]使用CM觀察角膜基質(zhì)細(xì)胞密度、數(shù)量及異常上皮下細(xì)胞，根據(jù)共焦圖像光強(qiáng)度分布測(cè)量角膜背向散射，發(fā)現(xiàn)FECD各期患者的前角膜背向散射升高，基質(zhì)細(xì)胞密度和前10%角膜基質(zhì)細(xì)胞絕對(duì)數(shù)降低，可見(jiàn)異常上皮下細(xì)胞，這些改變?cè)贒SEK后持續(xù)存在，影響術(shù)后視力和視覺(jué)質(zhì)量[28]。對(duì)這些變化的深入研究可能有助于揭示FECD的最佳干預(yù)時(shí)間。

2.2圓錐角膜圓錐角膜是一種雙側(cè)性、進(jìn)行性、角膜擴(kuò)張性疾病，由于不規(guī)則散光或角膜混濁損害視力，晚期常需角膜移植[29]。其病因目前尚不清楚，可能涉及許多因素，包括生化、遺傳和環(huán)境。早期診斷圓錐角膜有賴于角膜地形圖，其通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)精確分析整個(gè)角膜表面的形態(tài)和曲率的變化，診斷靈敏度、特異度高。CM從組織學(xué)角度觀察角膜，可發(fā)現(xiàn)圓錐角膜的早期改變，如后基質(zhì)層出現(xiàn)褶皺樣暗紋、細(xì)胞拉長(zhǎng)等，與角膜地形圖具有良好的互補(bǔ)性。此外，CM在圓錐角膜治療方法的探索上具有重要價(jià)值。角膜膠原交聯(lián)(corneal collagen cross-linking, CXL)是治療圓錐角膜的一種成熟技術(shù)，已被證明可以減緩或阻止其進(jìn)展，具有長(zhǎng)期的安全性和有效性，為避免紫外線對(duì)內(nèi)皮造成不可逆損傷，常規(guī)CXL要求去除上皮后角膜厚度在400μm以上[30]。近年有學(xué)者提出，可通過(guò)增加功能性角膜厚度來(lái)擴(kuò)展適應(yīng)證[31]。Mazzotta等[32]對(duì)圓錐角膜患者施行隱形眼鏡輔助的角膜膠原交聯(lián)(contact lens assisted collagen cross-linking, CACXL)：將隱形眼鏡浸泡于核黃素30min, 在照射紫外線前將其覆蓋于角膜表面，以增加功能性角膜厚度至400μm以上。術(shù)后使用CM隨訪觀察，術(shù)后3mo，患者角膜神經(jīng)開(kāi)始再生，到術(shù)后6mo，角膜神經(jīng)完全修復(fù)，前基質(zhì)細(xì)胞再生，周圍分布致密細(xì)胞外基質(zhì)，水腫消失，隨訪期內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞規(guī)則，密度無(wú)明顯改變，顯示CACXL可能是薄圓錐角膜安全有效的治療選擇。治療范圍上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也做了探索。Cassagne等[33]對(duì)比分析了地形圖引導(dǎo)的角膜膠原交聯(lián)(topography-guided CXL, TG-CXL)與常規(guī)CXL對(duì)進(jìn)展期圓錐角膜的療效和安全性。TG-CXL組根據(jù)角膜地形圖設(shè)計(jì)紫外線照射部位：以后角膜最高點(diǎn)為中心，包含前角膜異常軸向曲率范圍的錐形區(qū)域。術(shù)后通過(guò)CM發(fā)現(xiàn)TG-CXL組錐形區(qū)域和周圍區(qū)域間存在一模糊的分界線，周圍區(qū)域具有更輕微的去神經(jīng)和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，恢復(fù)得更快——TG-CXL具有更顯著的平坦效應(yīng)，誘導(dǎo)錐體和周圍區(qū)域間的生物學(xué)梯度，促進(jìn)神經(jīng)和細(xì)胞恢復(fù)，提高視敏度。Mastropasqua等[34]對(duì)10例晚期穩(wěn)定圓錐角膜患者施行飛秒激光輔助的基質(zhì)透鏡植入術(shù)，術(shù)后以CM觀察透鏡的存活情況，到術(shù)后6mo，透鏡內(nèi)大部分細(xì)胞形態(tài)趨于正常，呈規(guī)則明亮的反光，細(xì)胞外組織呈正常的透明性，顯示基質(zhì)透鏡已很好的整合于宿主角膜，肯定了該手術(shù)方式的有效性。

3共焦顯微鏡在全身疾病所致角膜病變中的應(yīng)用

3.1糖尿病周圍神經(jīng)病變糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病的主要長(zhǎng)期并發(fā)癥之一，發(fā)病率在50%以上，嚴(yán)重威脅患者生存質(zhì)量[35]。表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度(intra-epidermal nerve fiber density, IENFD)是評(píng)估小神經(jīng)纖維病變的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)早期診斷DPN有重要意義，但有創(chuàng)性限制了其在DPN診斷和研究中的應(yīng)用。角膜富含末梢神經(jīng)，是DPN重要受累部位之一。糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維密度下降，與IENFD改變顯著相關(guān)[36]。研究表明，CM具有與IENFD相當(dāng)?shù)脑\斷性能，可檢測(cè)小神經(jīng)纖維的早期病變，有良好的重復(fù)性，具有快速和無(wú)創(chuàng)的優(yōu)勢(shì)[37]。近期的一項(xiàng)薈萃分析匯總分析了13項(xiàng)研究，包括1680例受試者，獨(dú)立證實(shí)了角膜神經(jīng)纖維密度、長(zhǎng)度及其分支密度是區(qū)分有或沒(méi)有DPN的糖尿病患者與健康對(duì)照者的最佳參數(shù)[38]。Lovblom等[39]報(bào)道，隨訪1型糖尿病患者約4a，DPN發(fā)生率為17%，基線角膜神經(jīng)纖維長(zhǎng)度小于14.9mm/mm2是發(fā)生DPN的最強(qiáng)預(yù)測(cè)因素。

3.2干燥綜合征干燥綜合征(Sj?gren syndrome, SS)是一類主要累及唾液腺和淚腺的慢性、炎癥性、自身免疫性疾病，包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。眼表炎癥是干眼的關(guān)鍵事件。Hitomi等[40]利用CM觀察發(fā)現(xiàn)，SS相關(guān)干眼的角結(jié)膜炎癥細(xì)胞密度較非SS相關(guān)干眼顯著增高。通過(guò)CM測(cè)量的角膜背向散射已被證明是評(píng)估不同臨床情況下角膜炎癥的有效參數(shù)[41-42]。Lanza等[43]報(bào)道，原發(fā)性干燥綜合征相關(guān)干眼患者的角膜背向散射較健康對(duì)照組顯著增高。這些研究均顯示SS相關(guān)干眼存在更高水平的眼表炎癥。

3.3慢性移植物抗宿主病同種異體造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell tansplantation, HSCT)后，30%～70%的患者發(fā)生慢性移植物抗宿主病(chronic graft-vs-host disease, cGVHD)[44]，其中60%～90%累及眼睛[45]。cGVHD眼部病變表現(xiàn)多樣，最常見(jiàn)的形式是干眼，發(fā)生率為40%～76%[45-46]。He等[47]利用CM觀察發(fā)現(xiàn)cGVHD相關(guān)干眼患者角膜緣上皮DC密度和中央角膜球狀免疫細(xì)胞密度顯著高于無(wú)GVHD的HSCT受者，顯示cGVHD相關(guān)干眼患者眼表面的免疫激活和炎癥程度較高，兩者可作為cGVHD相關(guān)干眼患者眼表?yè)p傷和炎癥嚴(yán)重程度的可靠指標(biāo)。Kheirkhah等[48]道，CM下，cGVHD相關(guān)干眼的角結(jié)膜細(xì)胞變化與具有相同疾病嚴(yán)重程度的非GVHD相關(guān)干眼患者相似。Tepelus等[49]也觀察到兩者的CM表現(xiàn)沒(méi)有顯著差異。因此，cGVHD相關(guān)干眼的角結(jié)膜改變可能只代表了局部疾病嚴(yán)重程度。

綜上所述，CM以無(wú)創(chuàng)的方式將對(duì)角膜的觀察深入到微觀，提供更加客觀、真實(shí)的信息，在感染性角膜疾病、變性性角膜疾病及全身疾病所致角膜病變中具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。然而，隨著疾病研究的深入，CM應(yīng)用越來(lái)越廣泛的同時(shí)，也顯現(xiàn)出一些不足：(1)操作相對(duì)復(fù)雜，學(xué)習(xí)曲線較長(zhǎng),需要患者良好的配合；(2)重復(fù)定位較難；(3)無(wú)法準(zhǔn)確鑒別病原體及細(xì)胞等的種類，無(wú)法分辨細(xì)菌、病毒等體積更微小的病原體。未來(lái)，隨著技術(shù)進(jìn)步，操作更簡(jiǎn)便、定位更準(zhǔn)確、分辨率更高的CM將具有更加廣闊的應(yīng)用前景。