王萌萌 綜述，孔凡虹，宗曾艷，熊 丹,張秀明△ 審校

(1.深圳大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣東深圳 518001；2.安徽理工大學醫(yī)學院，安徽淮南 232000)

外泌體最初發(fā)現(xiàn)于網(wǎng)織紅細胞分化過程中，是胞漿內(nèi)的多囊泡體與細胞膜融合后，釋放到胞外基質(zhì)的直徑40～100 nm 的膜性囊泡。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)幾乎所有細胞都可分泌外泌體，且在唾液、尿液、血液、精液、羊膜液、腹水、肺泡灌洗液、乳汁、關(guān)節(jié)滑液及腦脊液等多種體液中均有分布[1]。而在所有類型的細胞中，腫瘤細胞分泌的外泌體尤為旺盛。外泌體中含有多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等，外泌體可介導細胞間物質(zhì)和信息傳遞，參與抗原提呈、免疫應答、蛋白質(zhì)和RNA的轉(zhuǎn)運等生理和病理過程。惡性腫瘤細胞分泌的外泌體，可攜帶多種腫瘤細胞特征性DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及各種蛋白等，進入腫瘤微環(huán)境，在腫瘤細胞和正常細胞之間傳遞，刺激腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。此外，由于外泌體中含豐富的母體信息且廣泛分布于各種體液，便于獲取的特點，對腫瘤的早期篩查、診斷及預后評估也具有重要意義。

1 外泌體、微泡及其他胞外囊泡的產(chǎn)生過程及機制

細胞分泌的胞外囊泡大致包括外泌體、微泡、凋亡小體，主要是按照形成方式的不同來劃分[3]。外泌體產(chǎn)生于細胞內(nèi)體系統(tǒng)，隨后早期內(nèi)體發(fā)育為晚期內(nèi)體，晚期內(nèi)體膜內(nèi)陷形成多泡小體(MVEs)，最后多泡小體與細胞膜融合，其內(nèi)大小形態(tài)均一的內(nèi)腔囊泡(ILVs)被釋放到細胞外，即為外泌體[4]。在此過程中，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸可被分選進入ILVs中。同時，晚期內(nèi)體還可與溶酶體結(jié)合對內(nèi)容物進行降解，或與再循環(huán)內(nèi)體結(jié)合參與內(nèi)容物的回收利用。微泡是由胞漿膜直接向胞外“出芽”產(chǎn)生，直徑為50～1 000 nm，沒有明確的分子標志，膜成分與原始胞漿膜類似。凋亡小體產(chǎn)生于細胞凋亡過程中，直徑為500～2 000 nm，其內(nèi)含有胞質(zhì)及細胞器[5]。

眾多研究表明，轉(zhuǎn)運必需內(nèi)體分選復合物(ESCRT)參與了ILVs和MVEs的合成[6]。ESCRT系統(tǒng)包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、SCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ 4種蛋白復合物。ESCRT-0能夠識別并隔離內(nèi)體膜上的泛素化蛋白質(zhì)，接著在ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ的共同作用下，質(zhì)膜變形并向內(nèi)凹陷形成小泡，最后在ESCRT-Ⅲ的剪切作用下與內(nèi)體質(zhì)膜分離。ESCRT-Ⅲ最終被ATP酶降解失去活性[7]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)外泌體生物合成過程并非完全依賴于ESCRT機制，有研究者發(fā)現(xiàn)在少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞系分泌的外泌體中，PLP的分選不依賴于ESCRT系統(tǒng)參與，而與神經(jīng)酰胺有關(guān)[8]。外泌體釋放到細胞外后，可通過胞膜融合、內(nèi)吞及與靶細胞表面受體結(jié)合3種方式進入靶細胞，實現(xiàn)細胞之間的信息傳遞。

2 外泌體的內(nèi)容物

外泌體為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性分子[9]。外泌體內(nèi)容物蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等組成隨細胞類型不同而有所差異，同一類型細胞在不同的外界刺激下如低氧、高糖、炎性反應等，其外泌體的蛋白質(zhì)和核酸成分也有所改變[10]。

近幾年來，通過對外泌體蛋白組學分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過4 000種蛋白質(zhì)可在外泌體中分離，這些蛋白質(zhì)一部分在進化上保守，與來源細胞無關(guān)，另一部分隨來源細胞不同而存在差異，具有細胞來源特異性。外泌體中含有的蛋白質(zhì)包括膜轉(zhuǎn)運和融合蛋白如GTP酶、annexins、Rab、flotillins，參與MVEs合成的蛋白如Tsg101、Alix，四次跨膜蛋白(如CD9、CD81、CD82、CD83、CD63，熱休克蛋白如Hsc60、Hsp90[11]。此外，細胞骨架蛋白、脂質(zhì)相關(guān)蛋白、抗原呈遞相關(guān)蛋白(MHCⅠ、Ⅱ等)、細胞信號通路蛋白也在外泌體中廣泛存在。四次跨膜蛋白、Alix、flotillin、Tsg101、Rab56被作為外泌體特異性的分子標志[12]。

除了蛋白質(zhì)，外泌體也富含豐富的鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神經(jīng)酰胺等成分，主要是細胞質(zhì)膜類似成分及隨來源細胞不同而變化的特殊脂類[13]。其中，骨形成蛋白、膽固醇、氧甾酮、神經(jīng)酰胺、磷脂酸、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等參與了外泌體的合成過程，外泌體被靶細胞識別與脂質(zhì)受體的參與有關(guān)。此外，外泌體攜帶具有生物活性的脂質(zhì)分子在細胞之間傳遞，對于調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)代謝具有一定的作用[13]。

外泌體內(nèi)含有豐富的核酸，包括基因組DNA、大量的mRNA、miRNA、LncRNA等。惡性乳腺癌細胞的外泌體中還含有mtDNA[14]。外泌體中的mRNA可被靶細胞攝取并在靶細胞內(nèi)得到表達，揭示了通過外泌體介導細胞之間基因傳遞的方式。

3 外泌體參與腫瘤多種生理病理過程

越來越多的證據(jù)表明，外泌體介導腫瘤細胞之間的信息傳遞對腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃逸等發(fā)揮重要作用。

3.1外泌體與腫瘤生長、增殖 腫瘤細胞分泌的外泌體能夠影響非腫瘤細胞產(chǎn)生腫瘤微環(huán)境從而更利于腫瘤的生長和增殖。已有多種體外細胞培養(yǎng)實驗證明：加入腫瘤外泌體的實驗組同等條件下細胞數(shù)量增長更多[15]。如腫瘤外泌體所含的生物活性成分隨外泌體進入腫瘤微環(huán)境，被包括內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等在內(nèi)的正常細胞及腫瘤細胞自身攝取，導致下游信號通路的改變，進而對腫瘤細胞生長、增殖、侵襲等產(chǎn)生影響，使其更有利于腫瘤的發(fā)展。腫瘤細胞外泌體中富含多種致癌性miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221、miR-451等，外泌體就攜帶致癌性miRNA在惡性腫瘤細胞之間傳遞，可能是調(diào)控腫瘤生長、侵襲的機制[16]。腫瘤細胞外泌體中含有的生存素和熱激蛋白等能夠抑制細胞凋亡從而促進腫瘤的增殖。如YANG等[17]證明膀胱癌細胞外泌體能誘導三級膀胱癌細胞系(T24)的抗凋亡基因Bcl-2表達水平上升和凋亡基因表達水平下調(diào)從而促進T24增殖。DONG等[16]最近的一項研究證明人類臍帶間質(zhì)充干細胞分泌的外泌體miR-410能促進肺腺癌的生長。可見，外泌體在腫瘤的生長過程中扮演著重要角色。綜上所述，腫瘤外泌體所含的蛋白及RNA在調(diào)控腫瘤生長、增殖過程中有重要作用。

3.2外泌體誘導腫瘤血管生成 腫瘤外泌體中含有豐富的血管生成因子能夠誘導腫瘤血管生成。研究表明腫瘤細胞外泌體中存在的多種信號分子，如c-Src、IGF-IR、GRK5和GRK6，以及c-Src具有促進腫瘤血管生成的潛能[18]。MROWCZYNSKI等[19]的實驗證明攜帶H63D HFE基因變體的神經(jīng)母細胞瘤外泌體也可以促進腫瘤細胞生長和WT HFE細胞的血管生成。人腦內(nèi)皮細胞能通過攝取外泌體分泌的VEGF-A提高血管生成的潛能。腫瘤細胞缺氧時，能促進肺癌細胞分泌富含miR-23a的外泌體，miR-23a能夠抑制內(nèi)皮細胞的EGLN2 和 EGLN1導致HIF1α累積從而促進血管生成[20]。由此，可以推斷外泌體可通過血管生成蛋白和外泌體miRNA的轉(zhuǎn)運誘導細胞間信號轉(zhuǎn)導來促進血管生成。

3.3外泌體與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移 向遠處侵襲及轉(zhuǎn)移是腫瘤的重要特征之一。研究表明，腫瘤產(chǎn)生的外泌體能夠通過調(diào)節(jié)多種信號通路促進腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。加上外泌體可攜帶功能性蛋白質(zhì)及核酸分子向血清、尿液、腦脊液、唾液等多種體液釋放，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)外泌體可透過血腦屏障向血液循環(huán)釋放，有理由推測，外泌體在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要作用。許多研究通過對腫瘤外泌體miRNA測序分析發(fā)現(xiàn)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種miRNA表達上調(diào)。如早期乳腺癌進行淋巴道轉(zhuǎn)移時，外泌體miR-222表達上調(diào)。而miR-222通過直接靶向作用于腫瘤抑制因子PDLIM2，激活NF-κB信號通路促進早期乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。ZHANG等[22]研究證明胃癌細胞釋放的外泌體可攜帶EGFR進入肝臟。隨后EGFR與肝基質(zhì)細胞質(zhì)膜結(jié)合，通過抑制miR-26a/b有效激活肝細胞生長因子(HGF)。HGF為轉(zhuǎn)移癌細胞提供“沃土”，促進轉(zhuǎn)移癌細胞在肝臟的增殖[22]。故外泌體介導的胞間交流在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。

3.4腫瘤免疫逃逸 腫瘤外泌體可以誘導腫瘤細胞產(chǎn)生免疫抑制功能，通過免疫細胞傳遞基因組DNA、mRNA和miRNA，從而使應答細胞具有重編程功能，促進腫瘤進展。外泌體可通過向免疫細胞傳遞抑制蛋白影響免疫細胞的發(fā)育、成熟和抗腫瘤活性。HSU等[23]表明，缺氧可以加速肺癌細胞的外泌體分泌，從而使外泌體攜帶的miR-103從缺氧的癌細胞中轉(zhuǎn)運到巨噬細胞，通過下調(diào)PTEN 增強M2的極化。從而使肺癌細胞通過外泌體抑制腫瘤巨噬細胞功能。此外腫瘤外泌體或可通過抑制免疫細胞功能以逃避腫瘤的免疫檢測。有研究將shRNA轉(zhuǎn)導入前列腺癌細胞中敲除Rab27a(DU145KD)基因抑制其外泌體分泌，發(fā)現(xiàn)當負載到樹突狀細胞時，DU145KD比對照組DU145細胞引發(fā)更強的抗腫瘤特異性T細胞免疫應答[24]。且外泌體可在免疫細胞向促腫瘤發(fā)生和促轉(zhuǎn)移表型修飾中發(fā)揮作用。VAN DER VOS等[25]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞外泌體可通過將miR21和miR451的傳遞將小神經(jīng)膠質(zhì)或巨噬細胞調(diào)節(jié)為免疫抑制表型。隨后證明了這種miRNA的轉(zhuǎn)移降低了受體小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞中的c-Myc mRNA，這可能是免疫抑制表型的致病因素。

4 外泌體在分子標志物方面的研究進展

外泌體參與腫瘤多種生理活動，且與正常細胞相比，腫瘤細胞可釋放更多數(shù)量的外泌體，預示著其可能作為一種潛在的生物標記物用于腫瘤的早期診斷、預后、放化療敏感性評估，以及治療研究。腫瘤細胞可釋放外泌體進入腫瘤微環(huán)境、血清、尿液、腦脊液及患者血液循環(huán)中。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清外泌體的某些特定RNA和蛋白質(zhì)與健康者相比較存在統(tǒng)計學差異，如研究證明通過循環(huán)外泌體GPC1水平測定，能從健康人樣本中準確區(qū)分PDAC患者樣本[26]。說明外泌體可作為一種新的生物標志物，為方便取材的血清或尿液基因診斷取代創(chuàng)傷大的組織活檢開拓了新的思路。液體活檢的最大優(yōu)勢是能夠在監(jiān)測和規(guī)劃治療前后提供臨床信息。研究證明循環(huán)外泌體是腫瘤相關(guān)分子(尤其是miRNA)的可靠來源，外泌體中特異性蛋白質(zhì)和miRNA的表達反映了它們的供體細胞的生理特性[27]。所有的腫瘤都分泌外泌體且與正常細胞相比腫瘤細胞分泌的外泌體含量更多[28]。且隨著腫瘤的發(fā)展，外泌體內(nèi)容物的含量和質(zhì)量都會有所改變，可以借此很好地判斷腫瘤所在的階段。另外，由于脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的保護，外泌體能在長期極低的溫度下維持穩(wěn)定狀態(tài)保護生物學特性，具有易于長期穩(wěn)定儲存的特征[29]。當前，已有公司(Exosome Diagnostics)推出全球首個基于外泌體RNA的液體活檢產(chǎn)品，這是一種基于血漿外泌體的診斷，可靈敏、準確、實時檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者的EML4-ALK突變。說明外泌體液體活檢技術(shù)應用于臨床診斷是必然趨勢[30]。KAHLERT等[31]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清外泌體KRAS 和 TP53基因突變，另外一項研究證明外泌體KRAS突變比CA19-9的水平測量更有利于胰腺導管腺癌患者預后分層分析[32]。由此可見，外泌體DNA也可為生物標志物來源。

5 外泌體在腫瘤治療中的應用

外泌體作為一類細胞來源的天然膜結(jié)構(gòu)，是機體內(nèi)存在的一種天然的細胞之間的交流媒介，能夠傳遞功能性的生物分子到靶細胞。此外由于脂質(zhì)雙分子層的保護，使其內(nèi)容物不在轉(zhuǎn)運過程中降解。因此，在藥物遞送方面的應用研究愈發(fā)受到重視，同時，利用外泌體增強機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤的能力對腫瘤進行治療也得到了更多的研究。目前，外泌體在腫瘤治療方面的應用主要集中在以下方面：用于免疫調(diào)節(jié)治療，作為傳輸化學治療藥物的載體或治療靶標[33]。外泌體作為藥物傳輸載體具有其天然優(yōu)勢：分子量小，固有的細胞靶向性，循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，能自由通過血腦屏障，同時，由于外泌體來源于人體，所以能成功規(guī)避免疫排斥反應[34]。SEO 等[35]研究顯示，健康小鼠CD8+T細胞活化后，細胞毒外泌體瞬間釋放，新生小鼠細胞毒外泌體浸潤間葉細胞密度高的血管區(qū)域。MSC的消耗與CD8+T細胞外泌體的優(yōu)先吞噬有關(guān)。說明CD8+T細胞除了對腫瘤細胞具有直接細胞毒性外，還能釋放外泌體，殺傷間充質(zhì)干細胞，抑制腫瘤進展。LI等[36]通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)結(jié)合A33抗體氧化鐵納米顆粒(A33Ab-US)的A33陽性外泌體具有良好的大腸癌靶向性，能夠靶向遞送阿霉素從而抑制腫瘤生長，降低心臟毒性延長小鼠的生存期。這項研究表明外泌體能與目標配體結(jié)合靶向傳遞抗腫瘤藥物，從而達到腫瘤治療的目的。ZHANG等[37]利用細胞聯(lián)合培養(yǎng)模型證明外泌體通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)運肝細胞生長因子(HGF)siRNA能夠抑制腫瘤的生長，表明外泌體外泌體可以作為siRNA的載體用于靶向癌癥治療。目前由于外泌體的標準分離方法的缺乏，以及過低的藥物裝載效率，ZHANG等[38]已根據(jù)外泌體的免疫治療作用制造出仿生人工嵌合外泌體(ACEs)有望代替天然外泌體用于臨床腫瘤靶向治療。

6 小 結(jié)

綜上所述，外泌體是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，攜帶具有功能性的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)分子，參與惡性腫瘤微環(huán)境中細胞之間的信息傳遞，對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管新生及免疫逃逸等過程有重要的意義。此外，人體體液中來源的外泌體，包含了多種不同細胞來源成分，尋找針對不同細胞來源的特異性分子標志物，對體液中外泌體的研究及未來“液體活檢”的發(fā)展也有重要意義，如用于腫瘤診斷及預后復發(fā)的指標。此外通過對外泌體內(nèi)容物的分析也可以判斷腫瘤的分期，分級和進展及腫瘤表型的分類和預后。將外泌體運用到精準醫(yī)療中，可以檢測那些無法通過組織活檢鑒定的腫瘤突變，實現(xiàn)腫瘤的早期診斷，提高癌癥患者生存率。在治療方面，將其作為治療藥物傳輸?shù)妮d體用于腫瘤治療也得到了相關(guān)的研究，相信隨著對外泌體認識的加深，以及越來越先進的外泌體分離、及藥物裝載方法的出現(xiàn)，其臨床應用會越來越廣闊，針對外泌體的腫瘤靶向治療方法也會為患者帶來新的治療希望。