呂艷關 綜述，劉穎穎 審校

(揚州大學附屬淮安市婦幼保健院：1.醫(yī)學檢驗科；2.新生兒醫(yī)學中心,江蘇淮安 223002)

膽道閉鎖(BA)是新生兒較常見的嚴重肝臟疾病之一，患兒肝內(nèi)外膽管發(fā)生進行性炎癥和纖維化，導致肝內(nèi)膽汁淤積、肝臟纖維化及硬化，臨床表現(xiàn)為黃疸、白陶土樣大便、尿色加深等，如果不予治療，患兒大多數(shù)會在一年內(nèi)因為肝功能衰竭而死亡。目前肝門空腸吻合手術(Kasai手術)是該病除了肝移植以外的唯一治療方式，大多數(shù)患兒可通過Kasai手術獲得膽汁引流，如手術后膽汁引流效果不好，在出現(xiàn)肝功能衰竭時再進行肝臟移植。多數(shù)觀點認為Kasai手術的最佳時機是出生后60 d以內(nèi)，但由于缺乏敏感、準確的檢查手段，導致很多患兒不能得到及時的治療，致使該病預后不理想，因此，其最大的挑戰(zhàn)是盡量在生命早期進行該病的篩查和診斷。術中膽道造影是診斷膽道閉鎖的金標準，但該檢測方法創(chuàng)傷較大。因此，尋求一種特異度和靈敏度高、無創(chuàng)或創(chuàng)傷性小的早期診斷BA的方法十分重要?，F(xiàn)對近年來膽道閉鎖診斷方面的最新進展進行概述，以期為臨床實踐和研究提供借鑒和參考。

1 血液來源的生物標記物

1.1常見的相關肝功能指標 雖然幾乎所有肝功能指標在BA中均可出現(xiàn)異常，特異性欠佳，但目前肝功能檢查對診斷BA仍有重要意義。對BA有輔助診斷意義的指標有很多。(1)反映肝臟合成功能的指標:總蛋白、清蛋白等主要由肝臟合成，當出現(xiàn)肝臟病變引起肝細胞受損時肝臟合成功能下降，總蛋白、清蛋白等在血清中的濃度也隨之下降；(2)反映肝細胞受損的指標：臨床上常用于反映肝細胞受損的肝功能指標有丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)等，以上酶廣泛分布于肝細胞中，當肝細胞受損或壞死時進入血液，通過測定血清中含量即可反映出肝細胞受損的情況。對于BA患兒，病變早期這些指標可正常，隨著病情進展表現(xiàn)為輕中度升高。2003年WAI等[1]建立了APRI模型即(AST與血小板的比值)，大量研究顯示該比值與肝臟纖維化分級成正相關，APRI在判斷淤膽性肝臟纖維化方面有較高的可靠性，對于膽道閉鎖肝纖維化的診斷敏感性及特異性分別可達到79%、88%[2-5]；(3)反映肝纖維化指標:有研究表明，血清透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、三型前膠原N端肽(PⅢNP)及Ⅳ型膠原(CⅣ)的水平變化可反映肝纖維化及肝硬化的程度[6-8]；(4)反映膽紅素代謝及肝臟膽汁排泄、淤積、分泌功能指標：臨床常用指標有總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)及總膽汁酸、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)及堿性磷酸酶等。膽紅素因其檢測方便快捷、價廉，是目前用于篩查BA最廣泛的血液生化學指標。POWELL等[9]研究表明，血清結合膽紅素用于篩查新生兒肝病的敏感性和特異性分別為100%和99.6%。微量血經(jīng)皮及點片法檢測直接膽紅素水平，是早期篩查膽道閉鎖的常用方法；血點片法檢查新生兒(<2周)直接膽紅素水平持續(xù)高于50 mg/L時，提示新生兒膽汁淤積癥可能性大[10]；經(jīng)皮測定膽紅素水平(TcB)無創(chuàng)、簡單易行，可檢測血清總膽紅素，如果TcB測定顯示黃疸持續(xù)3周及以上，應持續(xù)監(jiān)測并進行相關的檢查來進一步除外膽道閉鎖。膽道閉鎖患兒血清初級結合膽汁酸增高，且?；悄懰釢舛燃翱偰懼釢舛让黠@高于非BA膽汁淤積癥患兒及健康對照組，故測定血清各種膽汁酸濃度可用于膽道閉鎖的早期篩查[11]。FUKUOKA等[12]檢測了16名BA患兒及21名患有其他肝內(nèi)膽汁淤積癥的嬰兒十二指腸液中的總膽汁酸濃度，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出100%的靈敏度和90.5%的特異性，可以用作術前篩查以排除BA。有研究者對1 469名懷疑患有BA的患者進行膽管造影和/或手術探查，確診1 338名BA患者，研究比較BA和非BA患者的術前醫(yī)療記錄，結果發(fā)現(xiàn)BA組術前總膽紅素、直接膽紅素和GGT水平顯著升高(P<0.05)，而非BA組堿性磷酸酶水平較高(P=0.000 3)。該研究還指出如果使用GGT水平作為BA的診斷標志物必須考慮年齡，GGT水平有助于在120 d之前診斷BA[13]。雖然單純的肝功能檢查對診斷膽道閉鎖缺乏特異性，但可以反映肝臟的損害程度，且這些檢查為無創(chuàng)血液檢查，操作方面，對于診斷BA有一定的臨床意義。

1.2血清miRNA microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)為疾病的早期診斷和病因機制的研究提供了新的思路。miRNA是調(diào)節(jié)轉錄和翻譯的一種短鏈非編碼小RNA，與器官的生長發(fā)育密切相關，它的異常表達參與多種疾病的病理過程[14-16]，同時因其在組織、疾病中特異表達及其血液中表達較穩(wěn)定，可以作為BA早期篩查項目。YANG等[17]發(fā)現(xiàn)miR-29b和miR-142-5p能夠通過調(diào)節(jié)IFN-γ基因參與膽道閉鎖的發(fā)生與發(fā)展。PENG等[18]發(fā)現(xiàn)BA患兒15種miRNA改變明顯，用84例樣本(44例BA患兒、20例非BA膽汁淤積癥患兒和20例健康對照組)驗證其中4種miRNAs(miR-122-5p、miR-100-5p、miR-140-3p、miR-126-3p)，發(fā)現(xiàn)只有miR-140-3p升高有統(tǒng)計學意義。miR-140-3p診斷BA的ROC曲線下面積為0.75(敏感性為66.7%，特異性為79.1%)，該標記物可以作為早期非侵入性診斷BA的項目，并且提出miR-140-3p或許和BA發(fā)病機制相關聯(lián)，為BA病理機制的研究提出新思路。DONG等[19]發(fā)現(xiàn)13種miRNA改變明顯，75例樣本(45例BA，30例非-BA膽汁淤積癥)應用熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證其中8種miRNAs，發(fā)現(xiàn)只有4種miRNAs(hsa-miR-150-3p、has-miR-4429、has-miR-4689和hsa-miR-92a-3p)差異有統(tǒng)計學意義，他們可能通過調(diào)節(jié)各自的靶基因從而參與BA的病理進程。has-miR-4429和has-miR-4689診斷BA的ROC曲線下面積分別為0.789(敏感性為83.33%，特異性為80.00%)和0.722(敏感性為66.67%，特異性為80.00%)，他們可能作為潛在的BA早期診斷指標。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[20]，相比于非BA膽汁淤積癥患兒，miR-200b和miR-429在BA患兒中表達明顯增加，他們可能作為BA的早期篩查標記物。雖然類似研究有很多，但異常表達的miRNA能否作為BA的早期篩查項目,目前尚缺乏相關研究證實。

1.3血清蛋白質標記物的檢測 王家祥等[21]應用蛋白質組學的表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術和支持向量機(SVM)的方法，篩選出m/z位于3 403蛋白質標記物區(qū)分膽道閉鎖和正常對照小兒的血清蛋白指紋圖譜模型，敏感性100%，特異性100%，該模型為膽道閉鎖的早期診斷方法開拓了新方向，值得進一步研究。2D凝膠電泳和串聯(lián)質譜分析38例血清樣本(19例BA患兒和19例非-BA患兒)，研究發(fā)現(xiàn)：11種血漿蛋白(維生素D-結合蛋白、載脂蛋白H、甘露糖結合蛋白、α2-HS糖蛋白、甲狀腺運載蛋白、淀粉P混合物、硫酸類肝素多糖蛋白、補體C3、載脂蛋白E、載脂蛋白C、補體因子B)中，前七種蛋白在非BA膽汁淤積癥患兒中表達更高，后四種在BA患兒中表達更高，單一蛋白標記物無法區(qū)分BA，但是他們聯(lián)合可以區(qū)分BA和非BA膽汁淤積癥，為BA的非侵入性早期篩查提供了新方向[22]。SONG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ApoC-Ⅱ和ApoC-Ⅲ在BA中與其他組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，聯(lián)合這兩種標記物對BA診斷的敏感性為95%，特異性為93%；載脂蛋白的表達與肝功能密切相關，將來可能用于BA的早期篩查和診斷。

對于上述所及的無創(chuàng)性血液檢查指標，盡管在對膽道閉鎖診斷上有一定的參考意義，但上述血液學指標并沒有經(jīng)過大量研究認同，今后仍需要大量實驗研究給予進一步佐證。

2 糞便比色卡

糞便比色卡(SCC)將正常和異常糞便顏色真實地記錄在一張卡片上，正常包括黃色至綠色，異常包括白陶土色至淺黃色。通常做法是將卡片附在新生兒健康手冊上一起發(fā)給家長，如果家長發(fā)現(xiàn)大便顏色異常應盡快與醫(yī)療機構取得聯(lián)系，進一步確診或排除何種原因引起的梗阻性黃疸。SCC作為篩選BA的工具，在中國臺灣和日本得到了廣泛和有效地應用。TSENG等[24]對比了1996～2008年臺灣地區(qū)應用糞便比色卡前后BA篩查情況，發(fā)現(xiàn)應用糞便比色卡進行BA篩查后，疑似BA患兒住院日齡由47 d下降至43 d，Kasai手術平均日齡由51 d下降至48 d，60 d內(nèi)進行Kasai手術的比例從68.9%提高到73.6%，提高了自體肝5年生存率。日本報告稱SCC在BA診斷中的敏感性為76.5%，特異性為99.9%[25]。使用SCC篩查，可早期施行kasai手術，術后3個月黃疸清除率明顯增高，3年和5年自體肝生存率以及總體生存率均明顯提高[26]。應用SCC進行篩查可以早期發(fā)現(xiàn)BA，并在合適日齡時完成Kasai手術，從根本上提高膽道閉鎖自體肝的生存狀況。

3 尿液來源的標記物

尿硫酸化膽汁酸(USBA)檢測是一種無創(chuàng)性膽汁淤積檢測方法，研究者利用該方法通過改進標本采集和尿潴留的方法，用于降低假陽性率的BA篩查和早期檢測[27]。SHINKA等[28]利用電離子質譜分析，測定膽汁淤積和BA患兒尿液硫酸化?；悄懰猁}，發(fā)現(xiàn)其顯著增高，測定硫酸化牛磺膽酸鹽是新生兒BA的一種有效篩查方法。EL-GUINDI等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尿膽素原在0.32 mg/dL以下的臨界值可區(qū)分BA與其他非BA膽汁淤積，敏感性為88%，特異性為72%。當該臨界值與GGT在363 μ/L以上的臨界值相結合時，鑒別BA與其他膽汁淤積性疾病，敏感性為80%，特異性為100%。因此，尿膽素原是一種簡單、無創(chuàng)、廉價、靈敏、特異的標記物，特別是與GGT聯(lián)合應用，可用于診斷BA。ROCCHI[30]對患有嚴重膽汁淤積性疾病(膽道閉鎖、新生兒肝炎、正常嬰兒、成人膽道梗阻)的嬰兒和成人尿中的糞卟啉進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖、新生兒肝炎和成人膽道梗阻患者尿中糞卟啉的含量顯著增加，其中尿同型異構體Ⅰ增加明顯。尿中糞卟啉，特別是異構體分布的測定，可能是一個敏感的診斷工具。

4 影像學檢查

超聲檢查作為診斷BA重要的無創(chuàng)性工具，其準確性很高，但這需要專業(yè)的醫(yī)師操作，只能在專門的兒科超聲中心檢查。超聲診斷是臨床上常用的一種診斷方式，能夠通過超聲波掃描后成像，有利于疾病的判斷，從而選擇較好的方式治療。給予超聲診斷后，與手術造影相比，其對膽道閉鎖的診斷率相對較低，肝炎綜合征的診斷與手術造影相比無明顯差異。放射性核苷酸閃爍掃描(99Tc-HIDA掃描)具有較高的敏感性，在區(qū)分BA與不同原因引起的新生兒膽汁淤積具有較高的特異性[31]。但在掃描之前需給予嬰兒苯巴比妥3 d，并且重復成像長達24 h以在腸中尋找同位素活性。雖然超聲診斷對膽道閉鎖的診斷價值較高，但是在檢查中仍然需要注意以下的問題：(1)病史采集，對于出生后1個月仍然存在黃疸和白陶土樣大便的患者可懷疑發(fā)生了此??；(2)當患者膽總管囊腫形成時，則應注意膽囊的形態(tài)變化和收縮情況；(3)對哺乳前后膽囊的大小進行觀察可以判斷肝、膽管是否保持通暢等，但是在哺乳后發(fā)生收縮，則提示其肝外膽管未發(fā)生完全堵塞；(4)對肝臟進行觀察，了解是否出現(xiàn)肝臟增大，邊緣是否光滑等，從而對是否發(fā)生肝硬化進行判斷[32]。

BA與非阻塞性膽汁淤積(新生兒肝炎、腸外營養(yǎng)相關性膽汁淤積等)癥狀有相似之處，所以部分醫(yī)療機構經(jīng)過內(nèi)科觀察及藍光照射等治療會拖延診療時間導致手術時機的延誤。早期確診并施行手術，對其預后尤為重要。肝功能檢測需要反復取血比較其變化趨勢的做法，部分家長難以接受，依從性較低，且BA的肝功能結果與其他膽汁淤積性肝病有一定重疊，單純的肝功能檢查對診斷膽道閉鎖缺乏特異性。越來越多的研究顯示，miRNA在BA的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，血清miRNA也成為診斷BA的潛在標志物，但其能否用于BA的早期篩查還有待臨床大樣本研究的驗證。雖然目前miRNA尚不能應用于臨床診斷，但隨著高通量測序方法的不斷發(fā)展和檢測技術的不斷改進，相信會有更多與BA相關的miRNA被發(fā)現(xiàn)。血清蛋白質標記物的檢測并沒有經(jīng)過大量研究認同，今后仍需要大量實驗研究給予進一步佐證。尿液收集簡單無創(chuàng)，檢測結果可以初步判斷患兒是否存在膽汁淤積癥。糞便比色卡篩查方法一方面能夠提高患兒家長對膽道閉鎖的認知，另一方面由于其操作簡單，適宜推廣到各級醫(yī)院尤其是基層醫(yī)院和偏遠地區(qū)。是目前國際上許多國家和地區(qū)極力推薦和最有前景的BA早期篩查方法。影像學檢查醫(yī)師應具有一定的臨床經(jīng)驗，才可判斷出膽囊的發(fā)育情況、膽囊的收縮能力以及肝門部位的纖維斑塊準確位置。

目前，對于該病的早期診斷仍十分困難，所使用的診斷方法也形式繁多。目前我國缺乏規(guī)范、系統(tǒng)的膽道閉鎖的早期篩查項目，故仍然需要進一步的研究以發(fā)現(xiàn)高特異性及敏感性、非侵入性的標記物來早期篩查或診斷BA。