楊長青

一、 用反應(yīng)代謝物從化學結(jié)構(gòu)上預(yù)測具有肝毒性的藥物

反應(yīng)代謝物(reactive metabolites，RM)的概念首先來自于威斯康星大學醫(yī)學院米勒課題組的研究。他們首先證明了苯胺類偶氮染料的肝毒性和致癌性是由其氧化代謝后形成的RM所引起的。在將這一概念擴展到人類DILI的研究中，首先發(fā)現(xiàn)了細胞色素P450 (CYP)介導(dǎo)的抗炎藥對乙酰氨基酚的RM是反應(yīng)性醌-亞胺中間體，該中間體能夠耗盡機體內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)，并與肝蛋白共價結(jié)合?；谶@些以及過去3～4年間的許多其他毒性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)學研究，現(xiàn)在普遍認為，RM才是造成某些特異質(zhì)型DILI的病因。通過與細胞表面蛋白共價結(jié)合形成半抗原，RM可導(dǎo)致細胞的功能障礙或后繼免疫反應(yīng)。在眾多RM形成實驗中，已推導(dǎo)出這些特定的分子結(jié)構(gòu)，因而將這類特定分子結(jié)構(gòu)在已公示的信息中限定為“警示結(jié)構(gòu)”。例如，最近對68種被召回或與DILI黑框警告(BBW)相關(guān)的藥物進行分析表明，其中55種(81%)藥物具有警示結(jié)構(gòu)，而這55種藥物中確有36種(65%)存在RM形成的證據(jù)。因此從結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究中也可以看出，RM形成是特異質(zhì)型DILI的一個令人信服的論據(jù)，而RM缺失與后繼藥物的安全性顯著改善又是一致的。該報告將突出RM概念和結(jié)構(gòu)警報的證據(jù)，建議利用結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系作為評估上市前藥物發(fā)生DILI風險的獨立預(yù)測因子。

二、 應(yīng)用微工程化人肝細胞共培養(yǎng)模型預(yù)測藥物DILI風險

芝加哥伊利諾斯大學的Khetani教授認為，動物模型中的DILI并不總是與人類DILI相關(guān)，部分原因是藥物代謝途徑的物種差異。因此人類肝臟的體外模型現(xiàn)在正越來越多地應(yīng)用于補充、甚至在某些情況下取代動物試驗；更重要的是，這樣的模型能夠在整個化合物開發(fā)過程中更快、更經(jīng)濟地測試藥物和工業(yè)化學品的肝毒性。用原代人肝細胞模型評價化合物是篩選DILI風險的理想標準。然而在傳統(tǒng)的二維單細胞培養(yǎng)模式中，這類細胞還是表現(xiàn)出表型功能的快速下降。他們在過去的10～15年中，運用半導(dǎo)體驅(qū)動的微加工工具，以及肝細胞與肝臟或非肝臟來源的非實質(zhì)細胞的共培養(yǎng)技術(shù)，精確調(diào)節(jié)肝細胞周圍的二維和三維微環(huán)境，以增強和穩(wěn)定細胞表型功能。將肝臟來源的非實質(zhì)細胞(例如庫普弗細胞、肝星狀細胞和竇狀內(nèi)皮細胞)置于工程化肝細胞培養(yǎng)平臺中，可確定細胞-細胞間的相互作用在人類DILI進展中的作用途徑。利用患者特異性誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)衍生的人肝細胞和適應(yīng)性免疫攻擊來闡明特異性DILI的發(fā)生機制，也是未來努力的方向?？傊?，微工程化人肝細胞共培養(yǎng)模型具有預(yù)測上市前藥物發(fā)生DILI風險的巨大潛力，并有助于闡明DILI的潛在機制。

三、 評估藥物研發(fā)中DILI風險的新策略

臨床前的動物模型對檢測大多數(shù)人類的DILI普遍不敏感。因此，在藥物研發(fā)過程中需要對其DILI風險進行廣泛的評估。來自舊金山Genentech公司的Proctor博士采用了一組體外模型，并特別考慮了理化特性、警示結(jié)構(gòu)和預(yù)測劑量/暴露，以研究潛在的DILI風險。當然，在缺乏臨床前體內(nèi)肝毒性信息的情況下，很難利用體外數(shù)據(jù)來決定化合物的取舍。造成這一挑戰(zhàn)的因素之一是不確定哪些參數(shù)能夠真正預(yù)測DILI。這在一定程度上也是由于該領(lǐng)域的文獻中有許多相互矛盾的報道，這些報道使用了不同的測試系統(tǒng)、分類標準、統(tǒng)計方法和實驗條件，使得交叉研究比較困難。為了解決這個問題，他們開始評估藥物大量的生理化學特性，通過計算機模擬酶學和體外測定的整體預(yù)測性，使用一致的驗證系統(tǒng)，運用統(tǒng)計學方法單獨或組合地識別預(yù)測各參數(shù)的性能。在使用不同的測試系統(tǒng)對173種上市前化合物進行分析后，發(fā)現(xiàn)與臨床DILI相關(guān)的占47%。對于以IC50值為終點的參數(shù)，他們還通過校正每個化合物有效暴露時的最大血漿濃度來估計體外安全邊際(MOS)。

四、 計算機模擬和體外實驗?zāi)M，預(yù)測特異質(zhì)型DILI

在肝臟的適應(yīng)或“耐受”壓力方面，人與人之間存在著差異性，這也是特異質(zhì)型DILI發(fā)生的因素之一。來自哈姆納藥物安全研究所Howell博士重點討論了這一因素。肝細胞應(yīng)激反應(yīng)的改變影響著胞內(nèi)線粒體的生物形成能力，描述這一動態(tài)過程的數(shù)學模型已被納入到DILI評估系統(tǒng)：DILIsym。DILIsym是一項在歷時9年努力后，得到了19家最大的制藥公司、FDA和學術(shù)界共同支持所產(chǎn)生的一個DILI評估系統(tǒng)。它采用了“中間”定量系統(tǒng)毒理學(QST)的方法，并運用微分方程來概括藥物可能導(dǎo)致肝損傷的關(guān)鍵過程，通過改變參數(shù)來創(chuàng)建模擬的患者群體(SimPops)，以反映遺傳和非遺傳性變異。該評估系統(tǒng)已經(jīng)完成了軟件制作(DILIsym，DILIsym Services Inc.，Simulations Plus公司)，將會越來越多地應(yīng)用于制藥公司的開發(fā)決策。DILIsym已經(jīng)在多組上市前的藥物中進行了測試，其在80%以上的預(yù)測病例中都是準確的。