呂 燕 吳 林 陳 煒 黃曉丹 劉 璐 李興鋒 陳業(yè)文

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧市 530001，電子郵箱：576781394@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，南寧市 530023)

【提要】 自噬是機(jī)體通過吞噬作用將部分胞質(zhì)、受損細(xì)胞器和功能障礙蛋白質(zhì)等成分包裹形成自噬體，經(jīng)溶酶體途徑，消化包裹的內(nèi)容物后獲得營(yíng)養(yǎng)與能量的過程，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，以適應(yīng)外環(huán)境的變化。多項(xiàng)研究表明，自噬在阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓舞蹈病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。本文就近年來有關(guān)自噬在阿爾茨海默病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)又稱老年性癡呆，是老年人常見的癡呆類型，屬于神經(jīng)退行性疾病。該病起病隱匿，呈持續(xù)性發(fā)展，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的智能減退，最終導(dǎo)致患者完全喪失生活自理能力[1]。AD主要病理學(xué)特征為β淀粉樣蛋白(amyloid β-peptide,Aβ)沉積形成老年斑和異常高度磷酸化的tau蛋白導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)，從而引起神經(jīng)元及突觸的功能異常[2]，其屬于蛋白質(zhì)異常折疊性疾病。自噬是細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變或存在外界應(yīng)激時(shí)，通過自噬溶酶體途徑維持細(xì)胞的代謝平衡。研究表明,自噬功能障礙與由各種錯(cuò)誤折疊蛋白聚集體引起的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[3-4]。近年來，隨著對(duì)AD研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)自噬與AD的病理學(xué)特征密切相關(guān)[5]，自噬在AD發(fā)病中的作用機(jī)制越來越受到關(guān)注?，F(xiàn)就自噬在AD中的作用機(jī)制做一綜述。

1 自噬的概述

自噬是繼細(xì)胞壞死及凋亡性程序性細(xì)胞死亡后的第三種細(xì)胞死亡方式。Porter與Ashford于1962年將胰高血糖素注入大鼠肝細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了包裹有半消化的線粒體的某種致密體，他們把這種致密體的形成過程稱為自噬[6]。隨著研究的深入，自噬的相關(guān)基因(autophagy-associated gene，Atg)相繼被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)自噬有進(jìn)一步的了解根據(jù)細(xì)胞將物質(zhì)運(yùn)送至溶酶體內(nèi)途徑的不同，自噬分為3種類型：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)所產(chǎn)生的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)[7]。通常所說的自噬泛指巨自噬，其通過最終形成的自噬溶酶體降解內(nèi)容物，維持細(xì)胞內(nèi)代謝平衡。

1.1 自噬的形成及其相關(guān)基因 自噬起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基復(fù)合體膜脫落形成的自噬泡，細(xì)胞內(nèi)衰老或損傷的細(xì)胞器及變形或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被自噬泡包裹，逐漸延伸至將吞噬組分完全包繞隔離以形成自噬體，進(jìn)而與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的酶類將被吞噬包裹的組分進(jìn)行降解和循環(huán)利用，達(dá)到細(xì)胞本身代謝需要和受損細(xì)胞器的更新[8]。1997年，日本科學(xué)家克隆得到第一個(gè)酵母菌自噬基因，并將其命名為Atg1。此后人們相繼從酵母、線蟲、果蠅、高等脊柱動(dòng)物的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似同源基因[9]，并將此類基因命名為Atg，并在其后面加數(shù)字以區(qū)分不同基因[10]。目前已經(jīng)確定的約40個(gè)自噬相關(guān)基因中，Atg1-Atg10、Atg12-Atg14、Atg16和Atg18這15個(gè)編碼自噬蛋白的核心基因在哺乳動(dòng)物中是保守的[11-12]，因此認(rèn)為自噬在整個(gè)生物進(jìn)化過程中是高度保守的細(xì)胞行為。

1.2 自噬的功能 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化或處于應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，細(xì)胞通過自噬溶酶體降解清除功能異常的蛋白、核酸、細(xì)胞及細(xì)胞器等大分子物質(zhì)，重新為細(xì)胞提供能量與營(yíng)養(yǎng)的原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)及再利用，這個(gè)過程既是一種防御機(jī)制，又是一種應(yīng)激調(diào)控，不僅能抵抗外來病原體的入侵，又能清除胞內(nèi)代謝廢物，保持胞體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡。因此，當(dāng)自噬功能障礙而導(dǎo)致自噬水平過高或過低時(shí)均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的受損。

1.3 自噬的生物標(biāo)志物 檢測(cè)自噬標(biāo)志物可以動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、定量地了解細(xì)胞內(nèi)自噬的水平。目前，Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3)和p62蛋白常被用來評(píng)估機(jī)體自噬情況。

1.3.1 Beclin1：Beclin1是美國(guó)科學(xué)家Beth Levine克隆得到的第一個(gè)哺乳動(dòng)物自噬基因，是酵母ATG6的同系物[13]。Beclin1主要定位在反面高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，由450個(gè)氨基酸殘基組成，分子量60×104。Beclin1可以與ClassⅢ磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)結(jié)合形成復(fù)合物來調(diào)節(jié)其他自噬相關(guān)基因蛋白，募集胞內(nèi)的Atg5復(fù)合物(Atg12-Atg5-Atg16)和MAP1LC3，調(diào)節(jié)自噬的水平，且研究表明，自噬的活性隨著Beclin1表達(dá)水平的上調(diào)而升高，而Beclin1基因主要通過與PI3K形成的復(fù)合體來調(diào)節(jié)自噬的活性，是調(diào)控自噬的重要正調(diào)節(jié)因子，在自噬體早期的形成中起著關(guān)鍵的作用[14-17]。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Beclin1表達(dá)水平可以評(píng)估自噬活性。

1.3.2 MAP1LC3：MAP1LC3是在高等真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第1種自噬體膜蛋白，與酵母自噬相關(guān)蛋白Atg8為哺乳動(dòng)物的同源物,主要作用于自噬體前體的延伸與閉環(huán)[18]。MAP1LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型MAP1LC3主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，是自噬前MAP1LC3的表達(dá)形式[19]。細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，新合成的MAP1LC3經(jīng)過加工，形成可溶性Ⅰ型MAP1LC3。Ⅰ型MAP1LC3在自噬發(fā)生時(shí)經(jīng)過泛素樣化加工修飾后，與磷脂酰乙醇胺通過酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)結(jié)合形成Ⅰ型MAP1LC3，定位在膜結(jié)構(gòu)的自噬體前體和自噬體中，是常用的自噬體標(biāo)記性蛋白指示蛋白。膜結(jié)合型Ⅱ型MAP1LC3的含量可以反映細(xì)胞的自噬活性，Ⅱ型MAP1LC3與Ⅰ型MAP1LC3的比值與自噬泡形成的數(shù)量有關(guān)，常根據(jù)其比值或Ⅱ型MAP1LC3的表達(dá)水平判斷細(xì)胞的自噬活性[20]。

1.3.3 p62：p62/SQSTM1(sequestosome 1)是一種具有多種功能的接頭蛋白，是原癌基因c-myc編碼的基因表達(dá)產(chǎn)物，其不僅是泛素蛋白酶體系統(tǒng)的一種蛋白，也是自噬溶酶體系統(tǒng)的蛋白[21]，對(duì)降解底物的識(shí)別和包裹起著至關(guān)重要的作用[22]。它既是自噬體與底物之間的適配子蛋白，本身又是自噬過程中選擇性的底物之一。當(dāng)自噬上游的表達(dá)增強(qiáng)或者下游的降解被阻斷時(shí)，導(dǎo)致p62的聚集，進(jìn)入成熟的自噬體內(nèi)并被降解。在一些神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)自噬活性降低時(shí)，異常的蛋白質(zhì)聚集體和包涵體中常發(fā)現(xiàn)p62，p62的表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)[23-24]。此外，p62通過與MAP1LC3連接參與自噬體的形成，最終在自噬系統(tǒng)中被降解，因此在研究自噬時(shí)可聯(lián)合檢測(cè)p62的表達(dá)水平及Ⅱ型MAP1LC3與Ⅰ型MAP1LC3的比值以評(píng)價(jià)自噬的水平[25]。

2 AD與自噬

2.1 AD的發(fā)病機(jī)制 AD的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，可能有多種因素參與，包括Aβ沉積、tau蛋白的過度磷酸化、自噬損傷、突觸轉(zhuǎn)導(dǎo)功能異常、線粒體功能障礙、炎性機(jī)制、氧化應(yīng)激等[26-30]，其中比較公認(rèn)的機(jī)制是Aβ的生成與清除失衡導(dǎo)致神經(jīng)元變性和癡呆發(fā)生，以及過度磷酸化的tau蛋白影響神經(jīng)元骨架微管蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致NFTs的形成，進(jìn)而破壞了神經(jīng)元及突觸的正常功能，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。有學(xué)者對(duì)AD患者的腦組織進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)存在大量的自噬體[31-33]，證明自噬在清除異常聚集的Aβ和高度磷酸化的tau蛋白的過程中起著關(guān)鍵的作用[34]，調(diào)控自噬的水平或可成為防治AD的一種新手段[35]。

2.2 Aβ與自噬 Aβ是在細(xì)胞外的α、β和γ分泌酶的先后作用下，級(jí)聯(lián)剪切淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)產(chǎn)生的。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過調(diào)節(jié)Aβ的生成和清除，抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞程序性凋亡，對(duì)抗Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能[36]。Lucin等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠模型的腦組織中Aβ沉積之前，其神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)自噬體已顯著地增生、聚集。與正常小鼠相比，8～9周齡的雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠的神經(jīng)細(xì)胞自噬囊泡數(shù)目升高5倍，而9月齡的雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠則升高23倍以上。采用APP轉(zhuǎn)基因構(gòu)建的AD小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示，在AD早期Beclin1的表達(dá)水平降低，隨著 Beclin1表達(dá)水平的減少，神經(jīng)元細(xì)胞自噬程度減弱，細(xì)胞內(nèi)外Aβ沉積增多[38-39]，提示自噬功能異?？捎绊慉β的堆積。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在自噬缺陷的APP轉(zhuǎn)基因雜交小鼠腦組織內(nèi)，可觀察到細(xì)胞外的Aβ顯著減少，但細(xì)胞內(nèi)Aβ卻異常聚集、增加，提示Aβ在形成沉積斑塊的過程中受自噬的調(diào)節(jié)[40]。有研究表明，自噬與口服疫苗誘導(dǎo)的Aβ清除密切相關(guān)，調(diào)節(jié)自噬通路可能是預(yù)防和干預(yù)AD的一個(gè)重要策略[41]。Aβ的異常沉積是AD發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，若能以自噬通路中的某些信號(hào)分子為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)Aβ產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)AD防治具有重要的意義。

2.3 Tau蛋白與自噬 Tau蛋白是體內(nèi)含量最高的微管相關(guān)蛋白，可降低微管蛋白分子的解離，促進(jìn)微管的組裝，維持神經(jīng)元骨架微管蛋白的穩(wěn)定性和軸突正常運(yùn)輸?shù)淖饔肹42]。在正常的腦組織中，與tau蛋白穩(wěn)定結(jié)合的微管可以有效地介導(dǎo)自噬囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，以確保自噬的正常功能。而在AD患者腦組織中，可溶于水的異常磷酸化tau蛋白和異常修飾聚集成雙股螺旋絲的tau蛋白比例明顯增高，影響細(xì)胞的功能狀態(tài)[43]。病理狀態(tài)下的tau蛋白由于過度磷酸化形成NFTs，與微管結(jié)合的能力下降，失去了促進(jìn)微管組裝的生物學(xué)活性和維持微管穩(wěn)定的特性[44-45]，致使自噬囊泡不能向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，而導(dǎo)致自噬功能障礙。研究表明，tau蛋白高度磷酸化后，其生物活性降低，導(dǎo)致軸突運(yùn)輸障礙及自噬囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，引起神經(jīng)元軸突中的自噬體和營(yíng)養(yǎng)不良的AD神經(jīng)元突起數(shù)量增加，促進(jìn)神經(jīng)突起的炎性改變，神經(jīng)元的正常功能遭到破壞[46]。馮利杰等[46]研究發(fā)現(xiàn)自噬缺陷的細(xì)胞中tau蛋白和磷酸化tau蛋白降解速率降低，提示自噬參與過表達(dá)tau蛋白和異常磷酸化tau蛋白的降解，抑制自噬活性可增加tau蛋白的細(xì)胞毒性。Kim等[47]發(fā)現(xiàn)高度磷酸化tau蛋白的清除有賴于核點(diǎn)蛋白52受體介導(dǎo)的自噬功能。使用自噬抑制劑氯喹、3-甲基腺嘌呤，或通過激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路抑制自噬時(shí)，tau蛋白磷酸化程度增高、AD相關(guān)的病理表現(xiàn)更為嚴(yán)重[7，48],而使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后，自噬的活性增加，磷酸化的tau蛋白通過自噬系統(tǒng)被清除，AD的病理表現(xiàn)緩解[49-50]。以上研究均表明自噬在清除tau蛋白聚積的過程中扮演重要角色，當(dāng)自噬功能異常，不能有效降解、清除異常磷酸化的tau蛋白，可引起NFTs，從而導(dǎo)致神經(jīng)元及突觸的功能異常，誘發(fā)AD的發(fā)病。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，自噬作為機(jī)體內(nèi)的“清道夫”，其功能缺陷可導(dǎo)致Aβ生成增多或清除障礙，tau蛋白磷酸化及降解受阻，從而導(dǎo)致AD的進(jìn)一步發(fā)展，調(diào)節(jié)自噬通路中的有效信號(hào)或可成為AD治療的新靶點(diǎn)。