薛瑞豐，王經(jīng)琳，施曉雷，

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 普外科，江蘇 南京 210005；2.南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008）

肝移植是終末期肝病治療的唯一有效方法，但存在供肝來(lái)源相對(duì)短缺、術(shù)后需要終生服藥等問(wèn)題[1]，因此急需探索新的替代性治療方式。細(xì)胞移植和組織工程肝臟是替代性治療的兩個(gè)主要方向?，F(xiàn)有研究表明成體肝細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖能力低、規(guī)?；囵B(yǎng)困難，無(wú)法滿(mǎn)足臨床治療的需要[2]。目前細(xì)胞移植療法多使用干細(xì)胞，相比于成熟肝細(xì)胞，干細(xì)胞來(lái)源廣泛、增殖能力強(qiáng)[3]，但同樣也存在一些問(wèn)題如人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）涉及倫理，人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）的增殖受到表觀(guān)遺傳異常影響[4]，此外細(xì)胞的植入效率低、易轉(zhuǎn)移都是療效的不穩(wěn)定因素。組織工程肝是基于生物材料、細(xì)胞生物和工程技術(shù)的原理，用肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞結(jié)合支架材料，體外構(gòu)建一個(gè)完整的、具有功能的肝臟組織器官，用以對(duì)病變肝臟進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建進(jìn)而永久性替代的技術(shù)[5-6]。類(lèi)器官是組織工程肝的一個(gè)主要研究方向。類(lèi)器官是指以一定的順序和三維的方式在體外的聯(lián)合培養(yǎng)的具有細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的組織特異性細(xì)胞的集合。根據(jù)靶組織的不同，類(lèi)器官可以是球形也可以是不規(guī)則團(tuán)塊狀，直徑從0.1 mm到1 mm不等。他們?cè)诨虮磉_(dá)、組織結(jié)構(gòu)與體內(nèi)靶器官有明顯的同源性，且功能相似，經(jīng)歷類(lèi)似的細(xì)胞形成、生長(zhǎng)和成熟過(guò)程，通過(guò)原位/異位移植能發(fā)揮治療作用[7]。本文就近年來(lái)幾種主要肝臟類(lèi)器官構(gòu)建方式的研究進(jìn)展作一綜述。

1 類(lèi)器官的構(gòu)建方法

1.1 細(xì)胞片

細(xì)胞片是指在底部共價(jià)固定的聚N-異丙基丙烯酰胺（poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm）材料的溫度培養(yǎng)皿中，當(dāng)溫度高于臨界溶解溫度（lower critical solution temperature，LCST）32 ℃時(shí)，培養(yǎng)基表面略疏水，便于細(xì)胞黏附、擴(kuò)散、增殖；當(dāng)調(diào)控溫度低于32 ℃時(shí)，培養(yǎng)基表面和黏附的細(xì)胞之間形成水合層，細(xì)胞脫落可獲得完整薄片狀的細(xì)胞[8]。細(xì)胞片技術(shù)的關(guān)鍵是保證細(xì)胞-細(xì)胞連接和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白完整[9-10]。傳統(tǒng)的細(xì)胞移植方式如脾臟移植，易失去細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接作用支持，70%以上的肝細(xì)胞被巨噬細(xì)胞清除[11-13]。將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞（induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells，iPS-hlcs）以細(xì)胞片的形式移植到損傷肝臟的表面，細(xì)胞的定植率明顯提高，iPS-hlcs細(xì)胞片中形成血管結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，獨(dú)特的多層結(jié)構(gòu)解決了細(xì)胞大量移植可能引發(fā)的栓塞的問(wèn)題[14]。除了原位移植之外，肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培構(gòu)建的細(xì)胞片（engineered hepatocyte fibroblast sheets，EHFSs）移植到皮下，能分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)供肝的血管化，進(jìn)而提高移植的成功率[15]。細(xì)胞片能替代受損組織，改善器官代謝和內(nèi)分泌功能，并通過(guò)將各種蛋白遞送到受損組織減弱病理微環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響?，F(xiàn)階段臨床上使用的細(xì)胞片多來(lái)自于自體細(xì)胞，移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較低[16]。然而自體細(xì)胞的體外培養(yǎng)所需成本大、周期長(zhǎng)，限制了其發(fā)展的空間，同種異體細(xì)胞可能是未來(lái)細(xì)胞片技術(shù)發(fā)展的方向，但需要注意異種病毒的傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 脫細(xì)胞支架

器官或組織在去除細(xì)胞后剩余的結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的復(fù)合體即為脫細(xì)胞支架[17]。傳統(tǒng)支架主要有聚乳酸（polylactic acid，PLA）、乳酸-乙醇酸共聚物（Epoly 1actide-co-glycolide，PLGA）等生物聚合物材料支架和膠原、海藻酸鈉等天然材料支架[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸鈉（sodium laurylsulfonate，SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（triton X-100）或其他洗滌劑及酶解物經(jīng)肝門(mén)靜脈進(jìn)行循環(huán)灌注，細(xì)胞全部排出后，得到的脫細(xì)胞支架有如下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：有適合細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的三維多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)成分比例不變和主要血管結(jié)構(gòu)、膽管通道保持完整[19]。將小鼠再細(xì)胞化的支架移植進(jìn)大鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)新形成的肝臟能維持與體外正常肝臟相當(dāng)?shù)奶禺愋怨δ?，包括白蛋白（albumin，ALB）分泌、細(xì)胞色素P45表達(dá)和尿素合成。這些結(jié)果初步論證了再細(xì)胞化的脫細(xì)胞支架移植治療的可行性[20]，但支架的再細(xì)胞化過(guò)程仍可以進(jìn)一步優(yōu)化，如加入肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的和微血管內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)移植物血管化并防止由膠原基底膜直接暴露于血液中引起血栓[21]。將豬肝臟脫細(xì)胞支架血管內(nèi)壁用血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體覆蓋，促進(jìn)血管內(nèi)皮化，隨后再細(xì)胞化體內(nèi)移植，血栓形成明顯減少。此外，脫細(xì)胞支架細(xì)胞的定植和功能發(fā)揮需要生長(zhǎng)因子的協(xié)助，如胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[21]。同時(shí)輸注細(xì)胞密度和數(shù)量會(huì)影響細(xì)胞的定植和功能發(fā)揮[22]。鑒于構(gòu)成肝臟的幾種細(xì)胞功能和分布具有高度的綜合性和特異性，關(guān)于重建細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的研究尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道，可能是未來(lái)支架技術(shù)的發(fā)展的一個(gè)方向。

1.3 嵌合肝

嵌合肝是指同時(shí)具有免疫缺陷和肝細(xì)胞損傷死亡特性的動(dòng)物模型，經(jīng)其他來(lái)源肝細(xì)胞或干細(xì)胞移植后，供體細(xì)胞逐步增殖并取代宿主肝臟，形成含有不同種屬肝細(xì)胞的混合肝[23]。2004年Tateno C等[22]將人源性肝細(xì)胞脾內(nèi)移植到尿激酶型纖溶酶原激活物/重癥聯(lián)合免疫缺陷（urokinase-type plasminogen activator/severe combined immune-deficiency，uPA/SCID）小鼠中，供肝細(xì)胞增殖并取代宿主肝臟，構(gòu)建的嵌合肝模型能用于肝細(xì)胞功能和藥理學(xué)反應(yīng)的初步評(píng)估[24]，但也存在一些問(wèn)題如移植后供體細(xì)胞再增殖率低（15%）、小鼠病死率高等。Bissig KD等將肝細(xì)胞經(jīng)肝內(nèi)注射移植進(jìn)受體富馬酸乙酰乙酸水解酶敲除（fumarylacetoacetate hydrolase-deficient，fah-/-）小鼠，與uPA/SCID模型相比，構(gòu)建方法更簡(jiǎn)便，且供體細(xì)胞增殖模式與既往脾內(nèi)移植方式相似，細(xì)胞的再增殖率最高可達(dá)50%，且小鼠的存活率也有顯著提高。最近Ren XN等[25]用Alb-cre轉(zhuǎn)基因小鼠及白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor，DTR）轉(zhuǎn)基因小鼠與SCID小鼠雜交，得到轉(zhuǎn)基因免疫缺陷小鼠。腹膜注射白喉毒素誘導(dǎo)肝損后，人源肝細(xì)胞移植成功構(gòu)建了嵌合肝模型。血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、ALB分別于術(shù)后第7、28天恢復(fù)至正常水平，第30天在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)人源性Kupffer細(xì)胞。該研究成功構(gòu)建了一種具有可植入人肝細(xì)胞的新模型，小鼠肝臟可以攜帶人源性庫(kù)普弗細(xì)胞，且能維持肝細(xì)胞的增殖及功能發(fā)揮，為肝臟再生研究和疾病發(fā)展提供了基礎(chǔ)生物學(xué)研究平臺(tái)。

1.4 肝芽

小鼠胚胎發(fā)育的第9天，鄰近心臟中胚層和橫隔膜的前腸腹側(cè)區(qū)域增厚以形成肝憩室，隨后憩室從單層的立方形內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄬蛹購(gòu)?fù)層細(xì)胞（成體肝細(xì)胞）。成體肝細(xì)胞經(jīng)分層，增殖并轉(zhuǎn)移到周?chē)母裟M突以形成肝芽[26]。Takebe等[27]將人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的肝臟內(nèi)胚層細(xì)胞（induced pluripotent stem cell- endoderm cell，iPSC-HEs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和MSC體外共培構(gòu)建肝芽，移植到小鼠腸系膜，移植物能快速血管化并表現(xiàn)部分人類(lèi)肝臟特有的功能如產(chǎn)生ALB。Takebe等[28]首次成功構(gòu)建了體外血管化器官，證明了肝芽培養(yǎng)用于肝衰竭治療的潛力。鑒于肝芽培養(yǎng)重復(fù)性，擴(kuò)增規(guī)模的問(wèn)題，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合工業(yè)化技術(shù)，設(shè)計(jì)一種三維培養(yǎng)平臺(tái)陣列板，成功實(shí)現(xiàn)了體外肝芽得穩(wěn)定、大規(guī)模的擴(kuò)增培養(yǎng)，但因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)使用的基質(zhì)膠變異性較大，限制了肝芽得進(jìn)一步應(yīng)用。Ng SS等[29]設(shè)計(jì)了一種倒置膠體晶體（inverted colloid crystal，ICC）聚合支架，用于肝芽的培養(yǎng)。因?yàn)樵撝Ъ茏陨隙碌闹圃旆椒?，通過(guò)支架得孔徑，能定制細(xì)胞發(fā)育不同階段所需的基質(zhì)，完美的模擬肝芽生長(zhǎng)的細(xì)胞外生態(tài)位。ICC工程化產(chǎn)生的類(lèi)器官在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)分泌、藥物代謝和病毒感染方面更接近成體組織，并且在植入免疫缺陷小鼠的肝臟后可以整合入受體肝臟。

2 總結(jié)

肝臟是一個(gè)具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能的器官，原代肝細(xì)胞由于體外增殖能力低，培養(yǎng)成本高而無(wú)法滿(mǎn)足臨床治療的需求。通過(guò)干細(xì)胞或者以其為基礎(chǔ)的多種細(xì)胞共培，輔以生物材料技術(shù)手段，重現(xiàn)或取代肝細(xì)胞功能一直是類(lèi)器官構(gòu)建研究的方向，而細(xì)胞片、脫細(xì)胞支架、嵌合體和肝芽為制備人源化肝臟提供了有效途徑。細(xì)胞片技術(shù)強(qiáng)調(diào)細(xì)胞表面蛋白，細(xì)胞與外基質(zhì)之間作用蛋白的完整；脫細(xì)胞支架的應(yīng)用強(qiáng)調(diào)的是給細(xì)胞提供一個(gè)合適的生長(zhǎng)環(huán)境，輔之以促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。嵌合體要求受體對(duì)供體細(xì)胞較弱的免疫排斥，提供一個(gè)促進(jìn)供體細(xì)胞增殖的微環(huán)境。肝芽是多種細(xì)胞共培，通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，模擬體內(nèi)環(huán)境，自組裝成肝芽。從上述的構(gòu)建方式中，我們可以發(fā)現(xiàn)體外器官的重建，細(xì)胞間的相互作用，細(xì)胞外部的生長(zhǎng)環(huán)境兩者缺一不可。目前，上述方法均已取得了一定的成果，但離應(yīng)用于臨床肝移植仍有較大的差距，有待進(jìn)一步改進(jìn)。我們相信，多種學(xué)科聯(lián)合的類(lèi)器官技術(shù)將是解決供肝短缺的問(wèn)題的有效手段，能為終末期肝病治療帶來(lái)新的希望。