朱 程，黃桃翠，劉希忠，唐世義

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 400000)

諸葛菜(又名二月蘭)，屬十字花科蕓薹族諸葛菜種，常異花授粉植物。諸葛菜作為一種野生油料植物資源，具有油分品質(zhì)優(yōu)良和農(nóng)藝性狀較好的特點，種子含油量高達50%以上，特別是其亞油酸比例較高，有益于人體健康，是很好的油料植物。在農(nóng)藝性狀方面，諸葛菜的有效分枝、有效角果、每角粒數(shù)多，種子千粒重大、單株產(chǎn)量高，具有豐產(chǎn)潛力，故諸葛菜可以作為油菜的近緣種質(zhì)資源加以利用。近年來，隨著國家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實施，各地陸續(xù)開展形式各樣的油菜花節(jié)以促進旅游觀光業(yè)的發(fā)展。諸葛菜花瓣顏色為紫紅色，其與油菜遠緣雜交后代部分花色呈粉紅色，豐富了油菜花色，但遠緣雜種后代細胞多混倍體，花色性狀不能穩(wěn)定遺傳。前人采用不同方法，相繼開展了諸葛菜與甘藍型油菜物種間的遠緣雜交，獲得了諸葛菜和甘藍型油菜的有性雜種和體細胞雜種,并對雜種后代進行了形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)等方面的研究。重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究室通過胚挽救技術(shù)成功獲得了花瓣顏色為粉紅色的雜種后代。為培育穩(wěn)定的粉紅色觀光類油菜新品種，筆者對該雜種后代F6代進行形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)的分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1材料甘藍型油菜與諸葛菜屬間雜種F1經(jīng)連續(xù)3代實驗室胚挽救和大田自交3代，每代只保留具有粉紅花色特性的種子，得到較穩(wěn)定的粉紅花色F6代材料。

1.2方法

1.2.1形態(tài)學(xué)觀察。選取20個F6代株系，以油菜親本為對照，用游標卡尺測量開花期花瓣直徑，觀察花瓣形態(tài)和顏色，考察成熟期株高、分支起點、一次分枝數(shù)、主花序長度、主花序角果數(shù)等農(nóng)藝性狀。

1.2.2體細胞觀察。取組織培養(yǎng)幼苗的根尖,在0.002 mol/L 8-羥基喹啉中預(yù)處理4 h,用卡諾氏固定液Ⅱ(乙醇∶乙酸∶氯仿=6∶1∶3)固定24 h，轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。采用壓片法制片，壓片前,用1 mol/L HCl在60 ℃水里解離處理15 min，改良苯酚品紅染色，并在Olympus GX41顯微鏡下鏡檢，觀察攝影。

1.2.3花粉母細胞觀察。開花期取整個花序的花蕾,Carnoy氏固定液固定24 h，然后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。取2 mm左右花蕾，挑出花藥，用1 mol/L HCl 在60 ℃水里解離3～5 min，用改良苯酚品紅染色壓片法觀察花粉母細胞(PMC)減數(shù)分裂。

2 結(jié)果與分析

2.1植株性狀和花瓣形態(tài)甘藍型油菜與諸葛菜遠緣雜交F6代的20個株系中，有15個粉紅色株系(表1)，3個淡粉色株系，另還有2個株系花色為橘紅色(圖1)；對照組親本油菜的花瓣平均直徑為2.8 cm，粉紅和淡粉紅色株系花瓣的平均直徑分別為3.6和3.9 cm，顯著大于對照組；而橘紅色株系花瓣平均直徑為3.1 cm，與對照組相近。F6代株系植株株高的變化范圍為161.4～179.1 cm，平均株高為170.4 cm，各株系間變異幅度很小，對照組平均株高為196.5 cm，F(xiàn)6代植株株高顯著低于對照組，受株高影響，F(xiàn)6代植株平均分支起點高度只有37.8 cm，比對照組分支起點低81.2%，一次分支數(shù)平均為6.3個，顯著低于對照組的9.5個。F6代株系植株的主花絮長度變異范圍為47.3～60.3 cm，變異幅度較小，平均長度為54.2 cm，對照組植株的主花絮長度平均為66.5 cm；在主花絮角果數(shù)性狀上，F(xiàn)6代株系植株的最大值為78.2，最小值為52.1，平均為66個，對照組主花絮角果數(shù)平均為88.8個，兩者相差了20余個角果數(shù)。綜上所述，油菜與諸葛菜遠緣雜交F6代的植株雖然在花瓣顏色上存在較大的變異，豐富了油菜的花色，但其在各經(jīng)濟性狀指標上均顯著低于親本油菜。

表1 屬間雜種與親本油菜植株性狀和花瓣表現(xiàn)

注：從上往下依次為粉紅、淡粉紅和橘紅色花瓣Note:Pink,light pink and orange petals from top to bottom圖1 屬間雜種株系花瓣形態(tài)Fig.1 Petal morphology of intergeneric hybrid lines

2.2F6代株系細胞學(xué)特征20個F6代株系植株的根尖和子房細胞具有40、42、44、47和48條染色體，其中2n=42的植株出現(xiàn)頻率最高，染色體數(shù)為44的植株出現(xiàn)頻率也較高，且植株多為混倍體，其有絲分裂和減數(shù)分裂特征類似于五倍體植株。終變期花粉母細胞(PMCs)減數(shù)分裂配對構(gòu)型主要為21個二價體(n),同時也觀察到三價體和四價體的存在，后期I(Al)大多數(shù)表現(xiàn)出19∶23、19∶25和22∶25的分離方式，其他分離方式同時存在，在3～5個落后染色體以較低的頻率出現(xiàn)在某些株系的細胞內(nèi)，特別是在后期和末期I(后期和末期有時可以觀察到3～5條染色體被落后)，落后染色體和染色體橋與其他染色體同步分裂至細胞的兩極(圖2)。

2.3形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)分析橘紅花色植株體細胞2n=40的植株出現(xiàn)頻率最高，而粉紅花色植株體細胞染色體數(shù)目主要集中在42和44條，在減數(shù)分裂后期均發(fā)現(xiàn)落后染色體的存在，由于諸葛菜染色體的存在，F(xiàn)6代株系在農(nóng)藝性狀上與親本油菜存在較大的差異，具有明顯的諸葛菜特征。橘紅花色株系比粉紅花色株系的細胞染色體數(shù)目更接近親本甘藍型油菜，體細胞內(nèi)部來源于諸葛菜的染色體較少，因此其花色更接近黃色，花瓣大小也與親本油菜相近。在粉紅花色油菜株系中還發(fā)現(xiàn)了少量的淡粉紅色油菜，對比形態(tài)和細胞學(xué)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其中淡粉紅色植株往往比粉紅色植株更具有細胞學(xué)不穩(wěn)定性，這些植株多為混倍體，在后期I多發(fā)現(xiàn)染色體橋或落后染色體,在四分體之后往往形成多分孢子。

注：圖片依次為花粉母細胞減數(shù)分裂后期I、染色體數(shù)目為42的體細胞、減數(shù)分裂粗線期、細線期花粉母細胞；箭頭指向落后染色體Note:The pictures are pollen mother cells at anaphase I of meiosis,somatic cells with 42 chromosomes,pollen mother cells at pachytene and leptotene stages of meiosis;arrows point to lagging chromosomes圖2 屬間雜種株系植株的染色體數(shù)目和減數(shù)分裂Fig.2 Chromosome number and meiosis of intergeneric hybrid plants

3 討論

甘藍型油菜與諸葛菜屬間雜種的染色體數(shù)目理論上應(yīng)為62條，但經(jīng)過多代無性繁殖后F6代株系植株細胞染色體數(shù)目減少到40～48條，遠遠低于理論值，這說明甘藍型油菜與諸葛菜雜種體細胞染色體發(fā)生了大量的丟失，這種現(xiàn)象在甘藍型油菜與海甘藍和藍花子的雜種中也被觀察到[1-3 ]。這種現(xiàn)象可以用減數(shù)分裂驅(qū)動解釋。減數(shù)分裂驅(qū)動是指在減數(shù)分裂中由同源染色體的不等分離所引起群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的綜合機制，它對個體適應(yīng)值無利害關(guān)系，可使減數(shù)分裂中分離染色體多的一方增加連鎖群的頻率[4-5]。這種機制偏離了孟德爾定律，在新形成的異源多倍體中通過異染色質(zhì)、染色體斷裂或落后染色體、染色體橋的形成產(chǎn)生作用。

李再云[ 6 ]認為在甘藍型油菜與諸葛菜雜種植株的生長發(fā)育過程中及雜種苗的組織培養(yǎng)快速繁殖中均發(fā)現(xiàn)細胞消除現(xiàn)象，即有諸葛菜染色體的核質(zhì)雜種細胞逐漸被消除,產(chǎn)生的性細胞數(shù)目減少,從而造成2個種的染色體組在后代的差異傳遞率。在多代自交過程中，來源于諸葛菜的染色體在減數(shù)分裂后期通過形成落后染色體或染色體橋的形式逐步消除核質(zhì)雜種細胞，最終在雜種高世代基本剔除掉來源于諸葛菜的染色體。因此，該研究所獲得的屬間雜種體細胞中，染色體細胞數(shù)目不同程度的下降，很可能是甘藍型油菜的染色體組得到保留，而諸葛菜的染色體大量丟失的原因。

該研究發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜和諸葛菜屬間雜種F6代體細胞染色體數(shù)目為40、42、44、47和48條，其中2n=42的植株出現(xiàn)頻率最高；終變期花粉母細胞(PMCs)減數(shù)分裂配對構(gòu)型主要為21個二價體(n),同時也觀察到三價體和四價體的存在，后期I(Al)大多表現(xiàn)出19∶23、19∶25和22∶25的分離方式，有較多的落后染色體或染色體橋存在，這與前人在甘藍型油菜與諸葛菜屬間雜種后代的細胞學(xué)研究結(jié)論相近[7-10]。該研究的目的是以遠緣雜交后代表型偏粉紅花色的油菜變異群體進行形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)方面的研究，培育穩(wěn)定的粉紅觀光類油菜新品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)濟性狀方面，雜種后代表型帶有明顯的諸葛菜特征，不利于油菜的高產(chǎn)。今后，會提高屬間雜種自交代數(shù)，以期在高世代中找到經(jīng)濟性狀優(yōu)異且保留粉紅花色特征的油菜資源材料。