焦士蓉,唐子堯,孫博瑞,姚 瑤,王 周,陰文婭,馬思思

(1. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039; 2. 東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，日本 東京 113-8655;3.四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610065)

肥胖已經(jīng)成為世界性的流行病，可引起腎衰、脂肪肝、高血壓和某些癌癥[1-2]。肥胖的生成，與遺傳、環(huán)境及飲食習(xí)慣密切相關(guān)，特別是高能量飲食是導(dǎo)致肥胖的重要原因。除控制食用高脂飲食外，采用藥物治療肥胖癥也成為了重要手段；但可用于臨床治療的藥物少，且有毒副作用[3]。人脂肪干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)，存在于成熟的脂肪組織中，可通過分化、增殖生成脂肪細(xì)胞，而脂肪細(xì)胞的增加與脂肪組織體積的增大，可形成肥胖[4]；因此研究如何通過抑制脂肪細(xì)胞的增殖與分化，維持脂肪組織內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡，而達(dá)到抑制肥胖及相關(guān)疾病的目的，顯得尤為重要。Shiwani S等[5]的研究表明，多酚類物質(zhì)可以抑制脂肪細(xì)胞和誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡。石榴皮以其高含量的酚醛化合物、鞣花單寧、原花青素、復(fù)合多糖、黃酮類化合物等成分，表現(xiàn)出強的抗誘變、抗氧化、抗菌和抗凋亡特性[6-9]。May NAM等[10]的研究表明石榴及提取物對于預(yù)防和治療肥胖都有潛在的作用。同時鞣花酸為石榴皮中鞣花單寧的水解產(chǎn)物，研究表明鞣花酸對脂肪細(xì)胞有抑制作用[11]。但關(guān)于石榴皮及鞣花酸對人脂肪干細(xì)胞增殖及分化的影響的研究少有報道。本研究旨在探討石榴皮提取物及鞣花酸對人脂肪干細(xì)胞增殖及分化的影響，為預(yù)防和治療肥胖，為石榴皮資源的開發(fā)提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 實驗主要材料

DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液(美國HYCLONE公司)；胎牛血清(FBS,美國Giboc公司)；Ⅰ型膠原酶、油紅O染色劑、胰蛋白酶、醫(yī)用地塞米松注射劑(Dex)、人類重組胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司， 鞣花酸(MUST14031010，≧98%(成都曼思特生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純試劑。

1.2 石榴皮提取物的制備

石榴皮購買自成都中藥飲品有限公司。石榴皮的提取物方法及成分測定參考文獻(xiàn)[12]的方法

1．3 實驗方法

1.3.1 原代人脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[13-14]

通過經(jīng)患者同意的乳腺切除手術(shù)獲得健康乳腺脂肪組織， 500 U·mL-1雙抗的PBS，無菌條件下漂洗3遍，剪碎成1.0 mm3的組織塊，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，120 r·min-1，37 ℃消化60 min，加入DMEM/ F12培養(yǎng)液終止消化，1 200 r·min-1離心5 min，取下層脂肪干細(xì)胞和紅細(xì)胞等混合細(xì)胞的沉淀，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，200目過濾，以1×104～5×104個·cm-2接種至培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后換液，以后每3 d換液1次。原代培養(yǎng)生長融合達(dá)到90%，采用0.25%胰酶消化后，1 ∶3傳代接種到新的培養(yǎng)瓶中持續(xù)體外擴增培養(yǎng)，采用P3-P7代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCS增殖的抑制作用[13]

采用96孔板，每孔加入200 μL的完全培養(yǎng)液，稀釋密度為5×104個cells·mL-1hADSCs，37 ℃，5%CO2的條件孵育至細(xì)胞完全融合，棄去上清液。每孔加入200 μL分別含有25、5、1 μg·mL-1的石榴皮提取物；1.5、3.0、4.5 μg·mL-1鞣花酸的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM/F12，10%FBS，100 U·mL-1青霉素-鏈霉素溶液，1 μmol·L-1Dex，5 μmol·mL-1人醫(yī)用胰島素，0.2 mmol·L-1吲哚美辛，0.5 mmol·L-1IBMX),同時設(shè)誘導(dǎo)培養(yǎng)液+DMSO 0.1%為對照組，完全培養(yǎng)液+DMSO 0.1%為空白組，每組6個復(fù)孔。每3 d換一次液，經(jīng)14 d誘導(dǎo)分化后，用MTT法測定，540 nm波長下測定其吸光度A值，分別計算不同濃度石榴皮提取物(PoPE) 和鞣花酸(EA)對融合期hADSCS增殖的相對抑制率，公式如下：

相對抑制率=[(A1-A0)-

(A2-A0)]/ (A1-A0)×100%

式中:A0為空白孔的吸光度平均值；A1為對照組的吸光度的平均值；A2為各干預(yù)組的吸光度平均值。

1.3.3 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCS分化的抑制作用[13]

采用油紅O染色法, 觀察石榴皮提取物及鞣花酸對hADSCS分化能力的影響。采用24孔板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液，細(xì)胞接種密度為1×105個·孔-1，37 ℃，5%CO2孵育培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合，棄去上清液。每孔分別加入含有25、5、1 μg·mL-1的PoPE和4.5、3、1.5 μg·mL-1EA的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液, 進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并設(shè)置對照組(誘導(dǎo)培養(yǎng)液+DMSO 0.1%)、空白組(完全培養(yǎng)液+DMSO 0.1%)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。每3 d換一次液，經(jīng)14 d的誘導(dǎo)分化，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，用油紅O染色法測定甘油三酯的相對含量，490 nm波長下測定其吸光度A值。公式如下：

相對抑制率=[(A1-A0)-(A2-

A0)]/ (A1-A0)× 100%

式中:A0為空白孔的吸光度平均值；A1為對照組的吸光度的平均值；A2為各干預(yù)組的吸光度平均值。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 石榴皮提取物及鞣花酸對人脂肪干細(xì)胞增殖的抑制情況

如圖1所示，與對照組相比較，石榴皮提取物質(zhì)量濃度為25、5、1 μg·mL-1時，其對hADSCs的抑制率分別為31.87%、15.18%、13.99%，中、低濃度間沒有顯著性差異，與高濃度間有顯著性差異(P<0.05)。鞣花酸質(zhì)量濃度為4.5、3.0、1.0 μg·mL-1時，其對hADSCs的抑制率分別為47.23%、23.59%、15.77%(P<0.05)。

由圖1可知，石榴皮提取物及鞣花酸對hADSCs的增殖均有抑制作用，且成劑量效應(yīng)關(guān)系，另鞣花酸的抑制濃度顯著低于石榴皮提取物，也說明鞣花酸為有效活性物質(zhì)。

圖1 石榴皮提取物和鞣花酸對人脂肪干細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 石榴皮提取物、鞣花酸對hADSCs分化的抑制情況

加入誘導(dǎo)劑的第二到第三天，脂肪細(xì)胞中開始出現(xiàn)細(xì)小脂滴，隨著時間增加，脂滴呈串珠或戒環(huán)狀不斷增大。誘導(dǎo)14 d以后，形成成熟脂肪細(xì)胞，脂滴變圓且形狀飽滿，經(jīng)油紅O染色后，脂滴呈紅色，如圖2、圖3所示。

(從左至右：空白、對照、1、5、25 μg/mL)

(從左至右：空白、對照、1.5、3、4.5 μg·mL-1)

從圖2、3中空白與對照及PoPE和EA組可以看出，正常梭形細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)轭悎A形或多邊形，細(xì)胞內(nèi)積累脂滴，經(jīng)油紅O染色，PoPE和EA處理組脂肪粒的數(shù)量與對照相比，脂滴的數(shù)量和面積明顯減少，并隨著處理組濃度的增加，對脂滴形成的抑制作用顯著增加。

如圖4所示，石榴皮提取物為25、5、1 μg·mL-1時，與正常誘導(dǎo)對照組相比，其對hADSCs分化能力的抑制率分別為45.88%、24.30%、21.24%，中、低間沒有差異，與高濃度具有顯著性差異(P<0.05)。與正常誘導(dǎo)對照組相比，鞣花酸4.5、3.0、1.5 μg·mL-1時，其抑制率分別為44.96%、34.88%、28.23%(P<0.05)。

圖4 石榴皮提取物和鞣花酸對人脂肪干細(xì)胞分化的抑制作用

4 結(jié)論

肥胖已經(jīng)成了世界性的健康問題, 肥胖是由于個體能量的吸收大于消耗而引起的。從細(xì)胞水平考慮, 是由于單個脂肪細(xì)胞體積增大或脂肪細(xì)胞的數(shù)目增多而引起的。本研究表明, 在一定劑量范圍內(nèi), 石榴皮提取物與鞣花酸能夠劑量依賴性地抑制hADSCs的增殖與分化，減少脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的累積，可望開發(fā)為減肥降脂的純天然藥物。