王思思，鐘葵，史波林，汪厚銀，張璐璐，劉龍?jiān)?，趙鐳＊

（1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院 食品與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京 102200）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）屬蕓香科花椒屬落葉小喬木或灌木，在我國已有2000多年的栽培歷史。作為一種食藥兩用經(jīng)濟(jì)作物，花椒在我國分布極廣，在華東、華北、華中、西南、西北等地區(qū)均有栽培。受生態(tài)環(huán)境影響，不同產(chǎn)地花椒品質(zhì)特征具有明顯差異，這種差異導(dǎo)致其在應(yīng)用價(jià)值、價(jià)格上差別較大［1－5］。

香氣是花椒品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，易受氣候條件（日照時(shí)間、降水量、干燥度、氣溫等）以及土壤特性等的影響，因此不同產(chǎn)地花椒中揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量存在差異。樊丹青等［6］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)甘肅、四川等6個(gè)產(chǎn)地紅花椒的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同產(chǎn)地紅花椒中芳樟醇、乙酸芳樟酯等主要成分存在差異。陳光靜等［7］也采用GC-MS對(duì)陜西、甘肅、四川3個(gè)省8個(gè)產(chǎn)地的紅花椒揮發(fā)物進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)21個(gè)共有成分在不同產(chǎn)地紅花椒中存在較大的差異，非共有成分的含量均比較低。

為進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本范圍，并將物質(zhì)構(gòu)成分析與整體模式識(shí)別和數(shù)據(jù)挖掘相結(jié)合，更好地揭示我國紅花椒主產(chǎn)區(qū)、產(chǎn)地紅花椒的主要差異，本研究收集了我國西南、西北、華北、華東4大花椒主要產(chǎn)區(qū)16個(gè)不同產(chǎn)地紅花椒樣品。首先采用HeraclesⅠ快速氣相電子鼻技術(shù)從樣品揮發(fā)性組分整體模式特征上進(jìn)行分類，再采用GC-MS結(jié)合非監(jiān)督學(xué)習(xí)算法主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析對(duì)樣品進(jìn)行具體物質(zhì)構(gòu)成上的區(qū)分，同時(shí)運(yùn)用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）進(jìn)行變量重要性因子分析（variable importance for the projection，VIP），尋找區(qū)分不同產(chǎn)地花椒樣品的重要貢獻(xiàn)性物質(zhì)，以期為花椒產(chǎn)地識(shí)別、定向應(yīng)用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

花椒樣品均為大紅袍花椒，其中四川花椒樣品由成都珪一食品開發(fā)股份有限公司提供，其余樣品均由陜西省韓城市花椒管理局提供，詳細(xì)信息見表1。

表1 花椒樣品產(chǎn)地信息Table1 The origin information of Zanthoxylum bungeanum

1.2 儀器及試劑

HeraclesⅠ快速氣相電子鼻（配有Combi PLA自動(dòng)進(jìn)樣器，瑞士CTC公司） 法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀、2cm 50／30μm PDMS／DVB／CAR萃取頭、C6～C16 正構(gòu)烷烴標(biāo)品 美國Agilent科技公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江省上虞市沙篩廠；AL 104-1C型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 美國Supelco公司；PC-420D磁力加熱攪拌器 美國Corning公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HeraclesⅠ測定條件

1.3.1.1 樣品制備

依據(jù)GB／T 12729.2—2008《香辛料和調(diào)味品取樣方法》進(jìn)行取樣［8］，去除花椒中葉、柄、籽、閉目椒及其他雜質(zhì)，粉碎（約1min）過40目篩。準(zhǔn)確稱取0.20g花椒粉于20mL頂空瓶中，加蓋密封待測，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.3.1.2 檢測參數(shù)及程序

載氣（H2），流速160mL／min；頂空時(shí)間600s，頂空溫度60℃；進(jìn)樣量500μL，進(jìn)樣速率500μL／s，進(jìn)樣口溫度250℃；捕集肼溫度35℃，解吸溫度250℃；柱溫40℃，保持1s，以3℃／s升至250℃，保持30s；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度280℃；采集時(shí)間100s。

將裝有待測樣品的頂空瓶放入樣品托盤中，每3個(gè)平行后加1個(gè)空白樣（空瓶），以消除對(duì)下一個(gè)樣品的影響。

1.3.2 GC-MS測定條件

1.3.2.1 樣品制備

花椒粉制備方法同上，準(zhǔn)確稱取50mg花椒粉于20mL頂空瓶中密封待測，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.3.2.2 檢測參數(shù)及程序

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）條件：萃取溫度60℃，頂空時(shí)間20min，萃取時(shí)間30min。

GC-MS條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm，0.25mm）；載氣（He），載氣流速1.5mL／min；進(jìn)樣口溫度250℃；柱溫65℃，以25℃／min升至90℃，保持1min，以1℃／min升至105℃，保持2min，以3℃／min升至200℃，保持2min，以30℃／min升至250℃，保持2min；分流比20∶1。

質(zhì)譜參數(shù)：接口溫度280℃；離子源溫度230℃；電子電離源；電子能量70eV；質(zhì)量掃描范圍（m／z）35～500。

將吸附完成的SPME進(jìn)樣針迅速插入GC進(jìn)樣口，推出萃取頭解吸附15min，同時(shí)啟動(dòng)GC進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.4.1 GC-MS定性定量

通過NIST 14.0數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）對(duì)GC-MS檢測結(jié)果進(jìn)行鑒定，采用峰面積歸一法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行半定量分析。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 19.0對(duì)HeraclesⅠ響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，MetaboAnalyst繪制熱圖，SIMCA-P 11.5軟件對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和PLS-DA分析，GraphPad Prism 5.0繪圖。

1.4.3 保留指數(shù)計(jì)算

式中：Ix為保留指數(shù)；n為碳數(shù)；tr′（x）為保留在碳數(shù)n和n＋1正構(gòu)烷烴之間目標(biāo)化合物的保留時(shí)間；tr′（n）為碳數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；tr′（n＋1）為碳數(shù)為n＋1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 HeraclesⅠ響應(yīng)特征分析

HeraclesⅠ快速氣相電子鼻是結(jié)合傳統(tǒng)氣相色譜功能和電子鼻模式識(shí)別功能的分析儀器，由自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)（包括2根不同極性色譜柱和2個(gè)氫火焰檢測器）和數(shù)據(jù)接收系統(tǒng)組成。集合了氣相色譜高效分離和電子鼻快速識(shí)別的特點(diǎn)，常用于樣品中揮發(fā)性組分的快速分析［9－11］。

采用HeraclesⅠ對(duì)樣品進(jìn)行分析，得到保留時(shí)間-相對(duì)含量分布圖，見圖1。

圖1 紅花椒保留時(shí)間-相對(duì)含量分布圖Fig.1 Distribution map of retention time-relative content of Zanthoxylum bungeanum

圖1中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，代表信號(hào)響應(yīng)點(diǎn)；縱坐標(biāo)為相對(duì)含量，代表響應(yīng)強(qiáng)度。16個(gè)產(chǎn)地的紅花椒樣品共有56個(gè)響應(yīng)點(diǎn)，色譜柱1上有27個(gè)響應(yīng)點(diǎn)，色譜柱2上有29個(gè)響應(yīng)點(diǎn)。其中高于平均相對(duì)含量1.78%的響應(yīng)點(diǎn)共有14個(gè)（18.63-1，21.32-1，22.97-1，26.29-1，28.95-1，35.90-1，16.89-2，20.49-2，22.34-2，24.77-2，27.37-2，30.18-2，33.00-2，37.60-2），陜西、四川地區(qū)（Z4，Z11～Z16）有8個(gè)，河北地區(qū)（Z1）有9個(gè)，山西、山東、甘肅地區(qū)（Z2，Z3，Z5～Z10）有10個(gè)；高于10%的響應(yīng)點(diǎn)共有6個(gè)（22.97-1，26.29-1，35.90-1，22.34-2，24.77-2，37.60-2），其中甘肅臨夏積石山有2個(gè)響應(yīng)點(diǎn)，山東萊蕪萊城區(qū)有3個(gè)響應(yīng)點(diǎn)，其他地區(qū)均有4個(gè)響應(yīng)點(diǎn)。高于20%的響應(yīng)點(diǎn)共有2個(gè)（22.97-1和24.77-2），陜西、青海、甘肅地區(qū)無高于20%的響應(yīng)點(diǎn)，其他地區(qū)均有2個(gè)，見圖1。

采用系統(tǒng)聚類對(duì)16個(gè)產(chǎn)地紅花椒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。

圖2 紅花椒系統(tǒng)聚類分析圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of Zanthoxylum bungeanum

設(shè)定距離為10時(shí)，16個(gè)樣品可聚為3類。其中陜西、甘肅、青海地區(qū)聚為一類（Z3～Z7），代表我國西北花椒產(chǎn)區(qū)；河北、山西、山東地區(qū)聚為一類（Z1，Z2，Z8～Z10），代表我國華北、華東花椒產(chǎn)區(qū)；四川地區(qū)單獨(dú)聚為一類（Z11～Z16），代表我國西南花椒產(chǎn)區(qū)。三大類樣品在雙極色譜響應(yīng)圖上的差別主要表現(xiàn)在響應(yīng)點(diǎn)35.90-1和37.60-2的響應(yīng)強(qiáng)度上，西北地區(qū)樣品在這2個(gè)響應(yīng)點(diǎn)上的響應(yīng)值均高于10%，而西南地區(qū)樣品響應(yīng)值在5%～10%之間，華北、華東地區(qū)樣品響應(yīng)值則低于5%，呈現(xiàn)為有明顯差異的雙極色譜響應(yīng)雷達(dá)圖，見圖3。

圖3 紅花椒雙極色譜響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.3 Bipolar chromatographic response radar map of Zanthoxylum bungeanum

2.2 GC-MS定性定量分析

快速氣相電子鼻的結(jié)果顯示了在一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的物質(zhì)構(gòu)成上樣品間存在差異，為進(jìn)一步確定哪些物質(zhì)構(gòu)成及其含量存在差異，進(jìn)一步采用GC-MS對(duì)16個(gè)產(chǎn)地紅花椒揮發(fā)性組分進(jìn)行了定性和定量分析。

通過NIST數(shù)據(jù)庫檢索（匹配度≥80%）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了初步判定，再通過對(duì)比計(jì)算所得RI與文獻(xiàn)中的RI對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)一步確定［12，13］，并采用面積歸一化法進(jìn)行半定量分析。運(yùn)用MetaboAnalyst繪制不同產(chǎn)地樣品GC-MS分析熱圖見圖4。

圖4 紅花椒GC-MS測定結(jié)果熱圖Fig.4 Thermal map of GC-MS determination of Zanthoxylum bungeanum

熱圖中顏色由淺到深表示化合物含量依次增加。16個(gè)產(chǎn)地紅花椒共鑒定出62個(gè)組分，主要為烯烴類（31種）、醇類（17種）、酯類（8種）以及少量其他醛、酮類（6種）化合物。其中主要揮發(fā)性物質(zhì)有D-檸檬烯、芳樟醇、γ-萜品醇、乙酸芳樟酯、檜烯、β-月桂烯等，與陳光靜等報(bào)道的紅花椒中主要揮發(fā)性組分有月桂烯、檸檬烯、桉樹醇、芳樟醇、γ-萜品醇以及劉飛等報(bào)道的芳樟醇、乙酸芳樟酯、α-松醇、γ-萜品醇、檸檬烯的研究結(jié)果基本一致。與Zhu、Yang等［14，15］報(bào)道的乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬烯相比，本研究鑒定出的γ-萜品醇、檜烯、β-月桂烯等物質(zhì)的相對(duì)含量較高，這可能與所采用的提取方法不同有關(guān)。熱圖聚類結(jié)果表明16個(gè)不同產(chǎn)地紅花椒可以分為三類，其中陜西、甘肅、青海地區(qū)為一類（Z3～Z7）；河北、山西、山東地區(qū)為一類（Z1，Z2，Z8～Z10）；四川地區(qū)單獨(dú)聚為一類（Z1～Z16），與上述Heracles聚類結(jié)果一致。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)PCA及PLS-DA分析

PCA分析是利用降維思想，將原來的眾多變量通過降維、除噪轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)用于反映原來變量的信息［16，17］。利用SIMCA-P對(duì)16個(gè)不同產(chǎn)地紅花椒的GC-MS結(jié)果進(jìn)行分析，繪制不同樣品得分圖，見圖5。

圖5 GC-MS結(jié)果PCA得分圖Fig.5 PCA score plot of GC-MS results

由圖5可知，華北、華東地區(qū)（Z1，Z2，Z8～Z10）、西北地區(qū)（Z3～Z7）、西南地區(qū)（Z11～Z16）仍然可以有效區(qū)分，與上述聚類分析結(jié)果一致。

由于PCA、聚類分析都是一種非監(jiān)督的學(xué)習(xí)算法，即在不給定樣品標(biāo)簽的情況下進(jìn)行建模，側(cè)重于描述樣品分類趨勢，不能消除組內(nèi)噪音，不利于觀察不同類別之間的差異來源［18，19］。因而進(jìn)一步在PCA和聚類分析的基礎(chǔ)上采用一種有監(jiān)督的學(xué)習(xí)算法PLS-DA進(jìn)行建模。首先依據(jù)聚類結(jié)果對(duì)樣品預(yù)設(shè)分組，使用SIMCA-P軟件建模，以消除組內(nèi)噪音而突出組間的差異［20，21］，得分圖見圖6。

由圖6可知，三大類不同產(chǎn)地紅花椒得到有效區(qū)分，且聚類效果略好于PCA，表明PLS-DA模型可以有效消除組內(nèi)噪音和背景噪音。基于PLS-DA模型，對(duì)不同組別樣品中的差異物進(jìn)行分析，繪制VIP棒狀圖，見圖7。VIP值常用于評(píng)價(jià)PLS-DA模型中變量的重要程度，即變量在不同類別樣品區(qū)分中的重要程度，值越大表明該變量越重要，通常認(rèn)為VIP＝1.5的變量對(duì)樣品區(qū)分有相對(duì)較大的貢獻(xiàn)［22－24］。

圖6 GC-MS結(jié)果PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of GC-MS results

圖7 PLS-DA模型的VIP圖Fig.7 VIP plot of PLS-DA model

由圖7可知，16個(gè)紅花椒樣品區(qū)分貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)為γ-萜品烯，其VIP值為1.506，其次為大根香葉烯（VIP＝1.415）、α-依蘭油烯（VIP＝1.399）、α-松油烯（VIP＝1.392）、反式-2-蒈烯-4-醇（VIP＝1.351）、β-合金歡烯（VIP＝1.331）等。VIP得分說明γ-萜品烯、大根香葉烯、α-依蘭油烯、α-松油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯是區(qū)分華北、華東地區(qū)、西南地區(qū)、西北地區(qū)這三類紅花椒主要產(chǎn)區(qū)產(chǎn)地樣品的特征性揮發(fā)性成分。

對(duì)不同地區(qū)樣品中這6種物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖8。

圖8 VIP得分較高的6種物質(zhì)含量分布圖Fig.8 Distribution map of six substances with higher VIP score

由圖8可知，第一類地區(qū)（華北、華東）紅花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量均高于其他兩類地區(qū)，α-依蘭油烯含量與第三類地區(qū)（西南）水平相當(dāng)且高于第二類地區(qū)（西北），大根香葉烯和β-合金歡烯含量低于第三類地區(qū)而高于第二類地區(qū)；第二類地區(qū)γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量均低于第一類地區(qū)，γ-萜品烯、α-松油烯含量高于第三類地區(qū)；第三類地區(qū)大根香葉烯、β-合金歡烯含量高于其他兩類地區(qū)。整體而言，華北、華東地區(qū)紅花椒中大根香葉烯、γ-萜品烯、α-依蘭油烯、α-松油烯、β-合金歡烯、反式-2-蒈烯-4-醇6種物質(zhì)含量高，而西北地區(qū)含量高的物質(zhì)為γ-萜品烯和α-松油烯，西南地區(qū)花椒中大根香葉烯、α-依蘭油烯、β-合金歡烯、反式-2-蒈烯-4-醇含量高。

花椒揮發(fā)性組分相對(duì)含量的不同賦予其特有的香氣特征。6種特征物中，γ-萜品烯具有松木香、甜柑橘香等香氣特征，大根香葉烯具有青香、木香，α-松油烯具有檸檬似香氣，β-合金歡烯具有花香、木香、青香、膏香等香氣特征［25，26］。華北、華東地區(qū)中 γ-萜品烯、α-松油烯、β-合金歡烯、大根香葉烯含量較高，表現(xiàn)為偏柑橘香、檸檬香、木香、花香、青香等綜合香氣特征。西北地區(qū)中γ-萜品烯、α-松油烯含量相對(duì)較高，說明其香氣偏柑橘香、檸檬香。西南地區(qū)中大根香葉烯、β-合金歡烯含量相對(duì)較高，說明其香氣偏木香、花香、青香等香氣特征。

3 結(jié)論

本研究以我國4個(gè)花椒主要產(chǎn)區(qū)的16個(gè)花椒主要產(chǎn)地的紅花椒作為研究對(duì)象，首先采用快速氣相電子鼻對(duì)16個(gè)產(chǎn)地的紅花椒揮發(fā)性組分指紋信息進(jìn)行分析，以探討揮發(fā)性組分與產(chǎn)地的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上采用GC-MS技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地花椒樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行鑒定以分析不同產(chǎn)地樣品揮發(fā)性組分的差異。通過多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)我國不同產(chǎn)地紅花椒樣品可以分為三類，其中以四川為代表的西南地區(qū)為一類，以陜西、青海、甘肅為代表的西北地區(qū)一類，以河北、山西、山東為代表的華北、華東地區(qū)為一類，這與我國地理分區(qū)基本吻合，表明生態(tài)環(huán)境對(duì)紅花椒的香氣品質(zhì)有顯著影響。

在對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分后，對(duì)PLS-DA模型的VIP值進(jìn)一步展開分析以探討不同地區(qū)樣品揮發(fā)性物質(zhì)特征差異。結(jié)果表明：γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯可以區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)紅花椒樣品，是樣品間香氣差異來源。西南地區(qū)紅花椒中大根香葉烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量高，西北地區(qū)紅花椒中γ-萜品烯、α-松油烯含量高，華北、華東地區(qū)紅花椒中γ-萜品烯、大根香葉烯、α-松油烯、α-依蘭油烯、反式-2-蒈烯-4-醇、β-合金歡烯含量高。通過對(duì)6種物質(zhì)中4種具有香氣特征物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)華北、華東地區(qū)花椒偏柑橘香、檸檬香、木香、花香、青香；西北地區(qū)花椒偏柑橘香、檸檬香；西南地區(qū)花椒偏木香、花香、青香等。