王惠芳，樊君，榮秋亮，羅紅剛，劉書亮

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.千禾味業(yè)食品股份有限公司，四川 眉山 620010）

醬油是人們生活中必不可少的調(diào)味品。隨著人們生活水平的改善，對(duì)醬油品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。種曲作為醬油釀造的關(guān)鍵因素，對(duì)醬油的品質(zhì)至關(guān)重要。優(yōu)質(zhì)的種曲可提高出品率以及提升風(fēng)味、口感和感官體態(tài)。低劣的種曲會(huì)導(dǎo)致圓盤制曲的酶活力低，影響原料全氮利用率，醬醪布醬困難，不易出油，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自動(dòng)種曲機(jī)培養(yǎng)的種曲質(zhì)量好，勞動(dòng)強(qiáng)度低，細(xì)菌總數(shù)顯著改善［1，2］。本文以中科3.951米曲霉為菌種，研究了種曲機(jī)制曲工藝參數(shù)對(duì)種曲質(zhì)量的影響，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了種曲機(jī)制曲工藝參數(shù)，并對(duì)比了優(yōu)化前后種曲對(duì)醬油品質(zhì)的影響，以期為醬油釀造提供優(yōu)質(zhì)的種曲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器

CX31型生物顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備公司；ALKOMAT密度計(jì) 奧地利安東帕公司；W2S-185A型雷磁濁度儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；100kg種曲機(jī) 千禾味業(yè)食品股份有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌種

3.951 米曲霉：購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），凍干管。

1.1.3 斜面培養(yǎng)基

豆汁培養(yǎng)基：大豆常溫浸泡12h，加5倍水，小火煮沸1h過濾，調(diào)節(jié)濃度為5°Bé，加入2%瓊脂，分裝滅菌，制成斜面。

1.1.4 原料要求

麩皮：水分11%～13%，粗蛋白11%～14%，20目過篩率為40%～45%；酵母抽提物：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 23530－2009《酵母抽提物》中純品型［3］；空氣為無(wú)菌空氣，補(bǔ)水為無(wú)菌水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將凍干菌種3.951無(wú)菌操作接入豆汁斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5天，待斜面長(zhǎng)滿綠色的孢子，再無(wú)菌傳代2次，每次培養(yǎng)5天，獲得孢子密集的斜面種子。

1.2.2 三角瓶種子的制備

麩皮500g加入水500mL拌勻，搓碎去除團(tuán)塊，潤(rùn)水30min，再次混勻，分裝于500mL三角瓶中，每瓶30g，其厚度約為1cm。塞透氣硅膠塞子，包扎防潮紙，蒸汽加壓滅菌0.1MPa，維持30min。滅菌冷卻后，無(wú)菌接入2環(huán)試管斜面種子，30℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)17～19h后，曲料表面布滿白色菌絲并結(jié)塊時(shí)第1次搖瓶，曲料充分搖散平攤于三角瓶底部。再培養(yǎng)4～6h，菌絲大量生長(zhǎng)并結(jié)塊時(shí)第2次搖瓶，再次將曲料充分搖散平攤于三角瓶底部。培養(yǎng)48h后，曲料結(jié)塊可見大量的孢子時(shí)扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。

1.2.3 種曲機(jī)培養(yǎng)

種曲機(jī)投料共計(jì)100kg，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求配制原料，其中根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求需要使用酵母抽提物的，先按照潤(rùn)水比例取水，再將稱量好的酵母抽提物溶于水中，攪拌均勻后潤(rùn)水。曲盤裝料，厚薄均勻，厚度約2cm。蒸料溫度121℃，20min。降溫至30℃時(shí)，接入4瓶三角瓶種子，按照試驗(yàn)要求通風(fēng)和補(bǔ)水，培養(yǎng)72h開罐出曲。種曲機(jī)培養(yǎng)種曲工藝流程見圖1。

圖1 種曲機(jī)培養(yǎng)種曲工藝流程Fig.1 The technological process of cultivating seed koji with seed koji machine

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

分別針對(duì)潤(rùn)水量、風(fēng)量、補(bǔ)水量和酵母抽提物用量對(duì)種曲孢子數(shù)的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)。確定各個(gè)影響因素比較適合的范圍，為進(jìn)一步采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化提供有利的數(shù)據(jù)參考。潤(rùn)水量單因素試驗(yàn)：設(shè)計(jì) 70%，80%，90%，100%，110%，120%，130% 共計(jì)7個(gè)潤(rùn)水梯度，補(bǔ)水量為60L／罐，通風(fēng)量為1.5m3／h，30℃培養(yǎng)72h；風(fēng)量單因素試驗(yàn)：設(shè)計(jì)0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5個(gè)風(fēng)量梯度，按照潤(rùn)水量100%，補(bǔ)水量60L／罐，30℃培養(yǎng)72h；補(bǔ)水量單因素試驗(yàn)：設(shè)計(jì)20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8個(gè)補(bǔ)水梯度，按照潤(rùn)水量100%，通風(fēng)量為1.5m3／h，30 ℃培養(yǎng)72h；酵母抽提物用量單因素試驗(yàn)：設(shè)計(jì)未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8個(gè)梯度，潤(rùn)水量為100%，補(bǔ)水量為60L／罐，通風(fēng)量為1.5m3／h，30℃培養(yǎng)72h。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L16（45）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化種曲培養(yǎng)條件。4個(gè)因素為潤(rùn)水量、風(fēng)量、補(bǔ)水量和酵母抽提物用量，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，同時(shí)設(shè)置空列。各因素的不同水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)L16（45）的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test L16（45）

1.2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依照正交試驗(yàn)確定的最佳工藝參數(shù)制種曲，對(duì)比優(yōu)化前與正交優(yōu)化后的孢子數(shù)及用于醬油生產(chǎn)的成曲和原油指標(biāo)，驗(yàn)證正交優(yōu)化后的工藝參數(shù)。

操作要點(diǎn)：5kg大豆浸泡過夜，121℃加壓蒸煮30min，降溫30℃裹上15%的面粉，接種0.1%種曲，30℃培養(yǎng)45h得到醬油成曲，混入22%的鹽水10L，33℃發(fā)酵6個(gè)月。

1.2.5 數(shù)據(jù)測(cè)定方法

1.2.5.1 孢子數(shù)的測(cè)定

參照SB／T 10315－1999《孢子數(shù)測(cè)定法》［4］。

1.2.5.2 醬油理化指標(biāo)的測(cè)定

參照 GB 18186－2000《釀造醬油》［5］。

1.2.5.3 乙醇的測(cè)定

相對(duì)密度法［6］。

1.2.5.4 濁度的測(cè)定

濁度儀測(cè)定法［7］，取20mL壓榨后的生醬油用濁度儀測(cè)定。

1.2.5.5 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

平板計(jì)數(shù)瓊脂，成曲測(cè)定需加入防霉劑殺真菌素50mg／L。

1.2.5.6 中性蛋白酶活的測(cè)定

參照SB／T 10317－1999《蛋白酶活力測(cè)定法》［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 潤(rùn)水量對(duì)種曲質(zhì)量的影響

米曲霉生長(zhǎng)需要一定量的水分，接入三角瓶的種子需在原料上吸水膨脹后發(fā)芽，然后菌絲大量繁殖，其生長(zhǎng)過程需要耗掉大量的水分。所以原料必須有適量的潤(rùn)水，試驗(yàn)設(shè)計(jì)潤(rùn)水量為70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%共計(jì)7個(gè)潤(rùn)水梯度，補(bǔ)水量為60L／罐，通風(fēng)量為1.5m3／h，30℃培養(yǎng)72h，潤(rùn)水量對(duì)種曲質(zhì)量的影響見圖2。

圖2 潤(rùn)水量對(duì)孢子數(shù)的影響Fig.2 Effect of water moisture on the number of spores

由圖2可知，隨著潤(rùn)水量的增加，孢子數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，證明潤(rùn)水量并不是越高越好，適宜的潤(rùn)水量才適合米曲霉形成豐富的孢子。原料潤(rùn)水為米曲霉生長(zhǎng)提供了初始水分，潤(rùn)水量過低，會(huì)影響孢子的萌發(fā)速度，菌絲變得瘦而短；潤(rùn)水量過多，物料板結(jié)，米曲霉菌絲不易長(zhǎng)入物料的內(nèi)部，影響種曲質(zhì)量。潤(rùn)水量為100%時(shí)，物料疏松，料層通氧效果好，利于菌絲繁殖。相對(duì)而言，潤(rùn)水量低對(duì)種曲質(zhì)量影響較大，當(dāng)潤(rùn)水低于80%時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響種曲的質(zhì)量。

2.2 風(fēng)量對(duì)種曲質(zhì)量的影響

米曲霉生長(zhǎng)需要耗氧，因此風(fēng)量會(huì)影響米曲霉的生長(zhǎng)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5個(gè)風(fēng)量梯度，按照潤(rùn)水量100%，補(bǔ)水量60L／罐，30℃培養(yǎng)72h，風(fēng)量對(duì)種曲質(zhì)量的影響見圖3。

圖3 風(fēng)量對(duì)孢子數(shù)的影響Fig.3 Effect of air volume on the number of spores

由圖3可知，風(fēng)量為1，1.5，2，2.5m3／h時(shí)種曲孢子數(shù)差異不大，但隨著風(fēng)量的增加，孢子數(shù)降低，主要原因是風(fēng)量增加，風(fēng)速過快，會(huì)帶走物料的水分，從而影響米曲霉的生長(zhǎng)。風(fēng)量低于0.5m3／h時(shí)，則不能滿足米曲霉生長(zhǎng)的耗氧需求，影響米曲霉生長(zhǎng)。

2.3 補(bǔ)水量對(duì)種曲質(zhì)量的影響

種曲培養(yǎng)需要72h，培養(yǎng)的過程需要通入無(wú)菌壓縮空氣以滿足米曲霉生長(zhǎng)的耗氧需求，通風(fēng)的同時(shí)也會(huì)帶走物料的水分，如不額外補(bǔ)水，會(huì)導(dǎo)致物料發(fā)干，米曲霉不能正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8個(gè)補(bǔ)水梯度，按照潤(rùn)水量100%，通風(fēng)量為1.5m3／h，30℃培養(yǎng)72h，補(bǔ)水量對(duì)種曲質(zhì)量的影響見圖4。

圖4 補(bǔ)水量對(duì)孢子數(shù)的影響Fig.4 Effect of water replenishment amount on the number of spores

由圖4可知，補(bǔ)水量為50～80L／罐時(shí)種曲孢子數(shù)變化不大，但隨著補(bǔ)水量的增加，孢子數(shù)有下降趨勢(shì)，而補(bǔ)水量過低對(duì)孢子數(shù)的影響較大。

2.4 酵母抽提物對(duì)種曲質(zhì)量的影響

杜雙奎等［9］報(bào)道添加硝酸銨為米曲霉生長(zhǎng)提供了氮源。楊蘭等［10］的研究結(jié)果顯示，酵母抽提物對(duì)醬油種曲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較為明顯。酵母抽提物為食品原料，含有多種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)，因此，選擇酵母抽提物為種曲促進(jìn)劑，同時(shí)提供一定量的氮源。試驗(yàn)設(shè)計(jì)未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8個(gè)梯度，潤(rùn)水量為100%，補(bǔ)水量為60L／罐，通風(fēng)量為1.5m3／h，30℃培養(yǎng)72h，酵母抽提物用量對(duì)種曲質(zhì)量的影響見圖5。

圖5 酵母抽提物用量對(duì)孢子數(shù)的影響Fig.5 Effect of yeast extract amount on the number of spores

由圖5可知，添加了酵母抽提物的種曲，其孢子數(shù)明顯高于未添加的。用量為2%時(shí)孢子數(shù)最高，但隨著用量的增加，孢子數(shù)無(wú)明顯提高。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table2 Orthogonal test results table

根據(jù)極差R的大小，可以判斷因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響主次順序，由表2可知，極差值R由大到小依次為B＞C＞D＞A，因此，風(fēng)量對(duì)種曲質(zhì)量的影響最大，補(bǔ)水量和酵母抽提物的用量次之，潤(rùn)水量的影響相對(duì)較小。由k值的大小可判斷A、B、C、D各水平對(duì)本試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度。優(yōu)化后的組合為A3B3C3D4，即潤(rùn)水量110%，風(fēng)量2m3／h，補(bǔ)水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%，經(jīng)無(wú)菌種曲機(jī)培養(yǎng)72h后的種曲質(zhì)量最好。

2.5.2 正交試驗(yàn)方差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table3 Variance analysis table of orthogonal test

由表3可知，因素B有極顯著性差異，因素C和D有顯著性差異，說(shuō)明風(fēng)量對(duì)種曲孢子數(shù)影響最大，補(bǔ)水量和酵母抽提物用量對(duì)種曲孢子數(shù)也有較大影響。因素A無(wú)顯著性差異，說(shuō)明潤(rùn)水量對(duì)種曲孢子數(shù)無(wú)顯著性影響。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.6.1 種曲質(zhì)量對(duì)比

優(yōu)化后的工藝參數(shù)：潤(rùn)水量110%，風(fēng)量2m3／h，補(bǔ)水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%制種曲質(zhì)量有較顯著提高，孢子數(shù)平均值由優(yōu)化前的89.3億個(gè)／g（干基）提升到107.7億個(gè)／g（干基），提高了20.6%，進(jìn)一步證明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件可以提高種曲質(zhì)量。

2.6.2 醬油生產(chǎn)對(duì)比

將優(yōu)化前與優(yōu)化后的種曲用于圓盤制曲，成曲質(zhì)量對(duì)比見表4。

表4 優(yōu)化前后成曲質(zhì)量對(duì)比Table4 Comparison of the finished koji quality before and after optimization

由表4可知，優(yōu)化后的種曲用于圓盤制曲成曲細(xì)菌總數(shù)明顯降低，中性蛋白酶活略有提高，優(yōu)化前的成曲略有氨味和酸味。孢子數(shù)較低的種曲圓盤制曲時(shí)，不能很好抑制雜菌生長(zhǎng)，成曲中芽孢桿菌類增殖過多會(huì)導(dǎo)致成曲帶有氨味，而其他乳酸菌、微球菌等會(huì)導(dǎo)致成曲帶有酸味。優(yōu)化前后醬油質(zhì)量對(duì)比見表5。

表5 優(yōu)化前后醬油質(zhì)量對(duì)比Table5 Comparison of soy sauce quality before and after optimization

由表5可知，優(yōu)化后的醬油濁度明顯降低，導(dǎo)致醬油渾濁的原因除原料中未分解的大分子物質(zhì)外，另一個(gè)重要原因就是細(xì)菌性渾濁，比較優(yōu)化前和優(yōu)化后的醬油，生醬油中的細(xì)菌總數(shù)降低1個(gè)數(shù)量級(jí)。由于產(chǎn)酸細(xì)菌的減少，優(yōu)化后的生醬油的總酸低于優(yōu)化前的生醬油，氨基酸態(tài)氮、全氮均有提高。

3 小結(jié)

種曲機(jī)制曲工藝參數(shù)對(duì)種曲質(zhì)量有較大影響，其中風(fēng)量和補(bǔ)水量對(duì)種曲質(zhì)量影響較大，而潤(rùn)水量次之，酵母抽提物用量影響相對(duì)較小。米曲霉3.951用無(wú)菌種曲機(jī)培養(yǎng)的優(yōu)化條件為：潤(rùn)水量110%，通入風(fēng)量2m3／h，補(bǔ)水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%。優(yōu)化后種曲的孢子數(shù)可達(dá)100億個(gè)／g（以干基計(jì)）以上，用于圓盤制曲，成曲雜菌數(shù)降低，經(jīng)發(fā)酵后的醬油品質(zhì)較優(yōu)化前有大幅提升。