郭建，伍學(xué)明，樊君，左上春，劉英

(1.千禾味業(yè)食品股份有限公司，四川 眉山 620000；2.四川省調(diào)味品添加劑工程技術(shù)中心，四川 眉山 620010)

醬油是一種起源于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，它的歷史可以追溯到2000多年前[1]。目前，醬油的釀制方法包括高鹽稀態(tài)發(fā)酵、低鹽固態(tài)發(fā)酵和固稀結(jié)合的發(fā)酵方式[2]，其中高鹽稀態(tài)發(fā)酵方法日益成為國內(nèi)醬油釀制的主流方法。高鹽稀態(tài)釀造方法便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、節(jié)約化、清潔化生產(chǎn)，并且采用高鹽稀態(tài)法釀制的醬油呈香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良。

多種微生物參與到醬油釀造過程中[3]，伴隨發(fā)酵的進(jìn)行，醬醪微生物呈現(xiàn)此消彼長，菌群不斷更替，賦予醬油豐富濃厚的滋味。在眾多的微生物中，耐鹽酵母是醬油釀造的主發(fā)酵菌株，耐鹽酵母產(chǎn)生的酯類、醇類、醛類等物質(zhì)對(duì)醬油的香味影響最大[4]。用于醬油釀造的耐鹽酵母主要包括魯氏酵母、球擬酵母和假絲酵母，其中尤以魯氏酵母和球擬酵母應(yīng)用最廣。關(guān)于魯氏酵母和球擬酵母的報(bào)道較多，但是不同來源的魯氏酵母和球擬酵母對(duì)于釀造醬油的影響缺乏研究，本文選取4株具有代表性的魯氏酵母和球擬酵母應(yīng)用于醬油發(fā)酵，并深入考察了它們對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

米曲霉3.402，莫格球擬酵母CICC 1708，白球球擬酵母CICC 1019，魯氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 耐鹽酵母斜面培養(yǎng)基

酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，氯化鈉100 g/L，瓊脂粉20 g/L。

1.1.2.2 耐鹽酵母液體培養(yǎng)基

醬油原油，氯化鈉120 g/L，葡萄糖60 g/L。

1.1.2.3 制曲培養(yǎng)基

小麥炒熟，豆粕在121 ℃條件下滅菌20 min，然后按照小麥∶豆粕為3∶7的比例進(jìn)行混合，接種種曲后于30 ℃培養(yǎng)得成曲。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Alkomat酒精檢測儀 德國福林斯生化技術(shù)有限公司；分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)

鮮蝦中添加9%，12%，15%的食鹽，于4 ℃冰箱中冷藏，每15天取樣觀察并檢測蝦醬理化及微生物指標(biāo)。

1.2.2 發(fā)酵

配制23%的鹽水，按大曲∶鹽水為1∶2加入鹽水，攪拌均勻后于33 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.2.3 接種耐鹽酵母

單獨(dú)接種魯氏酵母或者球擬酵母按照106/mL的接入量接入，發(fā)酵第7天接入耐鹽酵母。組合接入魯氏酶和球擬酵母的方法：發(fā)酵第7天接入魯氏酵母，發(fā)酵第22天接入球擬酵母。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 生香酵母生長性能的測定

在斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)生香酵母于30 ℃培養(yǎng)2 天，之后用接種針接入1環(huán)至耐鹽酵母液體培養(yǎng)基中，其中氯化鈉的加入量分高鹽(18%)和低鹽(12%)2種，于30 ℃培養(yǎng)，間隔4 h取樣。將待測樣液10倍稀釋后用分光光度計(jì)測定吸光度值。

1.2.4.2 還原糖的測定

醬油還原糖的測定采用DNS法，具體步驟參照Zhu等[5]的方法。

1.2.4.3 乙醇濃度的測定

取100 mL待測醬油，加入100 mL蒸餾水，經(jīng)蒸餾后得100 mL餾出液，將餾出液用Alkomat酒精檢測儀測定酒精度即可。

1.2.4.4 醬油關(guān)鍵性呈香物質(zhì)濃度的測定

采用王春玲等的測定方法測定4-EG和HEMF的濃度[6]，采用Agilent 5977E GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀和CBP-20 極性毛細(xì)管柱(50 m×0.25 mm)。色譜條件：起始溫度60 ℃，保持10 min，以5 ℃/min進(jìn)行升溫，最終溫度180 ℃，保持15 min；氫氣流速47.0 mL/min，空氣流速400.0 mL/min，分流比20∶1，F(xiàn)ID 檢測器，檢測器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度 250 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均做3個(gè)平行，數(shù)據(jù)顯示為平均值±均方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母生長性能比較

在液體培養(yǎng)條件下，對(duì)2株魯氏接合酵母和2株球擬酵母在高鹽(18%)和低鹽(12%)2個(gè)濃度下的生長性能進(jìn)行了比較(見圖1)。高鹽條件下，莫格球擬酵母CICC 1708的生長性能明顯優(yōu)于其他3株菌，白球球擬酵母CICC 1019的生長最為緩慢，2株魯氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417生長性能則差別不大。

與高鹽條件下相似，低鹽條件下莫格球擬酵母CICC 1708依然生長最快，而白球球擬酵母CICC 1019的生長最慢，但是所有生香酵母的生長性能明顯優(yōu)于高鹽條件，說明隨著鹽濃度的提高，生香酵母的繁殖受到了明顯的抑制。

目前，國內(nèi)釀造醬油主要采用高鹽稀態(tài)的釀制方法，因此需要在高鹽條件下發(fā)酵性能優(yōu)越的菌株。當(dāng)然，僅具備高鹽條件下良好的生長性能是不夠的，還需要耐鹽酵母生成豐富的呈香物質(zhì)以提升醬油品質(zhì)。

圖1 生香酵母在高鹽(A)和低鹽(B)條件下的生長曲線Fig.1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

2.2 氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵過程中的變化

通過Ehrlich途徑，生香酵母可以將醬醪中的氨基酸轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸和短鏈支鏈醇[7]。適量地將醬油中的氨基酸轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸和短鏈支鏈醇有助于改善醬油風(fēng)味、提升醬油品質(zhì)，而氨基酸過多地消耗則有損醬油品質(zhì)。不同的生香酵母利用氨基酸的能力存在差異，因而生香酵母的加入可能導(dǎo)致醬醪中氨基酸態(tài)氮的含量發(fā)生變化。在發(fā)酵第10天分別接種4種生香酵母，并分別測定了發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化情況。

圖2 分別接種4種生香酵母后氨基酸態(tài)氮的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，接種不同菌株的醬醪中氨基酸態(tài)氮無顯著差異，最終氨基酸態(tài)氮都在1.2 g/dL左右，表明這4種酵母對(duì)氨基酸態(tài)氮的生成影響有限。

2.3 總酸在發(fā)酵過程中的變化

醬油總酸的主要成分包括氨基酸、乙酸、乳酸等酸類物質(zhì)，這些酸類物質(zhì)對(duì)醬油品質(zhì)影響很大。呈味氨基酸會(huì)賦予醬油更溫和的鮮味，乙酸、乳酸等酸類能增強(qiáng)醬油的滋味，乙酸、乳酸等還可經(jīng)酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酯類、醇類等呈香物質(zhì)。接種4種不同生香酵母后釀造醬油的總酸變化見圖3。

圖3 分別接種4種生香酵母后總酸的變化Fig.3 Changes of total acid after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖3可知，發(fā)酵前30天，總酸增長最為迅速，這與氨基酸態(tài)氮的生成量一致，表明發(fā)酵前30天總酸的主要成分為氨基酸。發(fā)酵30天以后，總酸增長較為緩慢，在這一階段主要?dú)w因于乳酸的快速繁殖致使乳酸、乙酸等大量積累。陳伯林的研究顯示，醬醪發(fā)酵前期主要是蛋白酶解及乳酸菌等細(xì)菌快速生長階段，隨著醬醪pH降低至5.0～5.5左右，酵母菌開始大量繁殖，菌落群態(tài)的更替引起醬醪中呈味物質(zhì)的顯著變化[8]。接種不同生香酵母的醬醪總酸差異不大，其中接種酵母菌株CICC 1379的醬醪總酸最低，接種不同酵母菌株引起的總酸含量的細(xì)微差異可能是醬醪中微生物菌落群態(tài)發(fā)生改變所致。

2.4 還原糖在發(fā)酵過程中的變化

糖類物質(zhì)對(duì)醬油滋味影響較大。首先，醬油甜味的形成主要?dú)w因于醬油中含有的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖等，這些糖類是經(jīng)由米曲霉分泌的酶類水解淀粉類物質(zhì)和木質(zhì)纖維素類物質(zhì)形成的[9]。其次，醬油中糖類物質(zhì)能經(jīng)由美拉德反應(yīng)或者微生物代謝轉(zhuǎn)化為色素，進(jìn)而引起醬油風(fēng)味的變化。分別接種4種生香酵母后還原糖的變化見圖4。

圖4 分別接種4種生香酵母后還原糖的變化Fig.4 Changes of reducing sugar after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖4可知，在發(fā)酵前30天，還原糖含量呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，這是由于米曲霉分泌的淀粉酶、纖維素酶水解原料產(chǎn)生了大量的糖類，同時(shí)發(fā)酵前期微生物生長緩慢，產(chǎn)生的糖類物質(zhì)大于消耗的量，進(jìn)而引起還原糖含量的顯著上升。圖4結(jié)果顯示，接種球擬酵母后醬醪的還原糖含量低于接種魯氏酵母的還原糖含量，這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，醬醪的pH逐漸降低，魯氏酵母耐受pH的能力不如球擬酵母，在發(fā)酵后期，魯氏酵母消亡而球擬酵母仍然能夠生長，較強(qiáng)的菌體活力使得球擬酵母的耗糖能力優(yōu)于魯氏酵母。

2.5 關(guān)鍵性呈香物質(zhì)在發(fā)酵過程中的變化

4-EG和HEMF是醬油中的關(guān)鍵性呈香物質(zhì)，乙醇是生香酵母產(chǎn)生的主要醇類物質(zhì)。4-EG是由球擬酵母將阿魏酸和4-羥基桂皮酸轉(zhuǎn)化而得[10]，HEMF則是D-木酮糖-5-磷酸經(jīng)酵母轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。分別接種4種生香酵母后90天這些關(guān)鍵性呈香物質(zhì)的變化見圖5。

圖5 接種不同生香酵母產(chǎn)4-乙基愈 創(chuàng)木酚、乙醇和HEMF結(jié)果比較Fig.5 Comparison of the content of 4-EG, alcohol and HEMF in soy sauce inoculated with different aroma-producing yeasts

由圖5可知，魯氏酵母CICC 1379所產(chǎn)乙醇含量最高(2.79 g/L)，球擬酵母CICC 1708所產(chǎn)乙醇含量最低(2.13 g/L)。總體而言，接種魯氏酵母的乙醇產(chǎn)量比接種球擬酵母的高。圖5結(jié)果顯示，球擬酵母CICC 1708產(chǎn)生4-EG的能力最強(qiáng)，達(dá)到1.103 g/L，CICC 1019產(chǎn)生4-EG的能力稍弱，而接種2株魯氏酵母的醬醪4-EG含量最低。王春玲等的研究指出魯氏酵母只產(chǎn)生HEMF不產(chǎn)生4-EG，而研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種魯氏酵母后仍有微量4-EG生成，這可能是發(fā)酵過程中引入了野生型酵母或者酵母菌株本身的發(fā)酵特性決定的。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)不論接種魯氏酵母還是球擬酵母醬醪中都會(huì)產(chǎn)生HEMF，但是接種魯氏酵母后HEMF的含量更高，其中接種魯氏酵母CICC 1417后醬醪中的HEMF達(dá)到0.048 g/L。

2.6 同時(shí)接種魯氏酵母和球擬酵母對(duì)釀造醬油香氣成分影響

上述結(jié)果顯示：球擬酵母和魯氏酵母產(chǎn)生的關(guān)鍵性呈香物質(zhì)存在差異，那么同時(shí)接種魯氏酵母和球擬酵母能否強(qiáng)化這些關(guān)鍵性呈香物質(zhì)的合成呢？同時(shí)接種不同魯氏酵母和球擬酵母對(duì)醬油關(guān)鍵性呈香物質(zhì)的影響見表1。

表1 生香酵母在高鹽(A)和低鹽(B)條件下的生長曲線Table 1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

注：1為同時(shí)接種CICC 1708和CICC 1417；2為同時(shí)接種CICC 1708和CICC 1379；3為同時(shí)接種CICC 1019和CICC 1417；4為同時(shí)接種CICC 1019和CICC 1379。

由表1可知，同時(shí)接種魯氏酵母和球擬酵母組合方式，4-EG和HEMF含量都得到不同程度的提高：同時(shí)接種CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分別達(dá)到1.26,0.063 g/L，較單獨(dú)接種魯氏酵母或球擬酵母效果好。同時(shí)接種魯氏酵母和球擬酵母后，乙醇含量也較單獨(dú)接種強(qiáng)，其中接種CICC 1019和CICC 1379后乙醇含量最高，達(dá)到3.35 g/L。有研究表明魯氏酵母和球擬酵母存在拮抗效應(yīng)[11]，拮抗效應(yīng)的存在可能最終影響醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成，但是對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)的影響仍然缺乏研究。本研究通過不同魯氏酵母和球擬酵母的組合接種，探究對(duì)關(guān)鍵性呈香物質(zhì)形成的影響，這對(duì)提升醬油品質(zhì)具有重要的理論指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過單獨(dú)或組合接種2株魯氏酵母和2株球擬酵母的方式，深入考察了魯氏酵母和球擬酵母對(duì)釀造醬油品質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)組合接種魯氏酵母和球擬酵母的方式優(yōu)于單獨(dú)接種魯氏酵母或球擬酵母，其中同時(shí)接種CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分別達(dá)到1.26，0.063 g/L。本研究深入揭示了魯氏酵母和球擬酵母對(duì)醬油關(guān)鍵性指標(biāo)的影響，為提升醬油品質(zhì)提供了指導(dǎo)。