彭英 唐鷺 裴新發(fā) 張學(xué)志 林百豐 陳麗 于艷玲 李發(fā)濱

作者單位：150036 哈爾濱，黑龍江省結(jié)核病預(yù)防控制中心

結(jié)核分枝桿菌(MTB)中有一類具有相似遺傳背景的北京基因型菌株，這些菌株分布廣泛，在世界各地都發(fā)現(xiàn)有北京基因型菌株的流行，在中國地區(qū)，北京基因型菌株具有相當(dāng)高的密度，超過80%的MTB屬于北京基因型菌株[1]。通過對北京基因型菌株的分布和傳播規(guī)律的研究，可以揭示其對分子流行病學(xué)的影響。

近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了感染性疾病的流行病學(xué)研究，重復(fù)性好、分辨率高的分子分型方法主要依賴于MTB基因組的重復(fù)序列，包括插入序列(insertion sequence，IS) 6110、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列-分枝桿菌散在重復(fù)單位(variable number tandem repeats-mycobacterial interspersed repetitive units，VNTR-MIRU)等。其中以PCR為基礎(chǔ)的間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)是用于鑒定MTB家族遺傳機構(gòu)的重要技術(shù)，特別是在區(qū)分北京基因型和非北京基因型方面，但是該技術(shù)操作過程繁瑣，結(jié)果判讀較復(fù)雜[2]；可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)分析是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因分型方法，該技術(shù)的分辨率更高，結(jié)果更易分析，且具有很高的重復(fù)性，特別是其數(shù)字化的結(jié)果展現(xiàn)形式使得不同實驗室之間的結(jié)果相互比較[3]。 基于MTB插入重復(fù)單位和數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列基因分型方法受到越來越廣泛的重視，大大擴(kuò)大了基因分型適用范圍。本研究通過對黑龍江省五常市收集的MTB 7位點VNTR基因多態(tài)性分析，初步探究當(dāng)?shù)豈TB的傳播特征，為當(dāng)?shù)赜行Э刂平Y(jié)核病提供有效的工具。

資料和方法

一、一般資料

菌株來源于2009年6月至2010年10月黑龍江省五常市結(jié)核病門診收集的固體羅氏分離培養(yǎng)陽性的121株MTB。121株MTB分離株的患者男84例、女37例，男∶女=2.27∶1。年齡范圍17～85歲，<40歲 41 例，40～歲 50 例，≥60 歲30例。初治119例，復(fù)治2例。對所有入選患者采用比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測其耐藥性，用RD105缺失基因檢測和7個位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats，VNTR)進(jìn)行分子分型，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供，培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.主要儀器：GeLDoc2000nin凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；DYY-6B型水平電泳儀由北京六一儀器廠生產(chǎn)。

2. 主要試劑：MTB分型鑒定試劑盒(含 MTB 鑒 定 、16S rRNA、QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、QUB11a、Mtub21、VNTR3820等組分)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

二、研究方法

(一)藥敏試驗

采用傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗對4種一線抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇進(jìn)行檢測，培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度分別為 0.2、40、4、2 μg/ml。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))×100%，以耐藥百分比>1%定義為耐藥。

(二)MTB菌型分析

針對人型MTB特異性序列設(shè)計引物MTB1和 MTB2，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性IS6110設(shè)計引物IS6110-P1和IS6110-P2，分別擴(kuò)增361 bp和245 bp 兩條帶，來鑒別該檢測菌株是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

引物序列：MTBl：ATAGGGAATGCTCGGCAAC；MTB2：CAACATCGACGCAGTACCC；IS6110-P1：TGAGGGCATCGAGGTGGC；IS6110-P2：GCGTAGGCGTCGGTGACAAA。

(三) “北京基因型菌株”鑒定

差異區(qū)域105(RD105)的缺失是北京基因型菌株所特有的[4]，通過檢驗該區(qū)域的缺失來鑒定樣本是否為北京基因型菌株，北京基因型菌株分型通過PCR對RD105缺失區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用100 bp DNA ladder 作為分子量標(biāo)志，在紫外燈下觀察擴(kuò)增片段長度，擴(kuò)增產(chǎn)物在1495 bp的條帶是非北京基因型菌株，786 bp條帶的為北京基因型菌株。

(四)VNTR位點的選擇

按照文獻(xiàn)[5] 要求篩選MTB 7個VNTR基因位點，引物由復(fù)旦大學(xué)設(shè)計、北京康為世紀(jì)公司合成。引物序列見表1。

(五)MTB DNA模板的制備

將收集到的MTB陽性菌株接種于L-J培養(yǎng)基，37 ℃孵育培養(yǎng)2～4周至菌落生長，從固體培養(yǎng)基上刮取結(jié)核分枝桿菌 1～2 環(huán)重懸于400 μl TE 緩沖液 (pH值為8.0)中，80 ℃ 30 min滅活，煮沸10 min，13 400×g離心2 min，取上清，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 MTB 7個VNTR基因位點的PCR引物序列

(六)PCR擴(kuò)增

20 μl PCR反應(yīng)體系中，模板DNA 1 μl，2×Taq PCR Master mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司) 10 μl，ddH2O 8 μl，上下游引物各 0.5 μl。

擴(kuò)增條件：除VNTR 3820位點的PCR擴(kuò)增條件不同外，其他6個位點的PCR擴(kuò)增條件均一致。

VNTR3820位點PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。

其他6個位點PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。

(七)瓊脂糖凝膠電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠[含4 μl/80 ml溴化乙錠(EB)DNA染料]恒電壓(5 V/cm)電泳1.5 h，通過DNA Marker和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的VNTR位點重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)參照，根據(jù)擴(kuò)增片段大小計算出被測菌株VNTR 位點的重復(fù)單元數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入Excel 2003軟件，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。北京基因型和非北京基因型菌株對一線抗結(jié)核藥物的耐藥率組間差異比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。聚類分析先用Gel-Pro analyzer 3.1軟件精確確定實驗獲得的每條DNA條帶分子量大小，將指紋圖譜數(shù)字化后，再根據(jù)每個特異性位點重復(fù)單元的大小及特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物邊緣序列的長短進(jìn)一步確定每個特異位點重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)，獲得針對每個菌株的數(shù)字編碼，在此基礎(chǔ)上再運用Bionumerics 5.0軟件進(jìn)行聚類分析。聚類分析所獲基因群按患者年齡、性別及治療分類(初治與復(fù)治)進(jìn)行分組，組間差異采用Fisher精確概率檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

計算實驗菌株成簇率：實驗結(jié)果完全相同的菌株定義為一簇，成簇率為成簇菌株占總試驗菌株的百分率，即：成簇率=成簇菌株數(shù)/總菌株數(shù) × 100%。

Hunter-Gaston分辨指數(shù)(Hunter-Gaston Index，HGI)：各個VNTR位點重復(fù)序列的總體分辨指數(shù)計算公式如下：

N為菌株總數(shù)，s為所有基因型數(shù)目，nj為第j個基因型的菌株數(shù)。HGI<0.3為分辨率低，0.3～0.6為分辨率中，>0.6為分辨率高。

近期感染率最小估計值計算公式如下：近期感染率=(nc-c)/n×100%；其中nc指成簇的菌株，c代表菌株成簇數(shù)，n代表菌株總數(shù)。

結(jié) 果

一、實驗菌株對藥物的敏感性及其與北京基因型的關(guān)系

本研究共納入121株結(jié)核分枝桿菌菌株，其中北京基因型101株，占83.5%(101/121)；非北京基因型20株，占16.5%(20/121)。121株菌株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素的耐藥率分別為5.8%(7/121)、3.3% (4/121) 、5.0%(6/121)、15.7%(19/121)。其中北京基因型菌株對上述藥物的耐藥率分別為5.0%(5/101)、3.0% (3/101) 、5.9%(6/101)、17.8%(18/101)；非北京基因型菌株對上述藥物的耐藥率分別為10.0%(2/20)、5.0% (1/20) 、5.0%(1/20)、未檢出對乙胺丁醇耐藥0.0%(0/20)。北京基因型菌株和非北京基因型菌株的總耐藥率分別為31.7%(32/101)、20.0%(4/20)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.090，P=0.296)。121株菌株中耐多藥率為2.5%(3/121)，其中2株為北京基因型，1株為非北京基因型。北京基因型和非北京基因型耐多藥率分別為2.0%(2/101)和5.0%(1/20)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.531，P=0.460)。見表2。

二、7位點VNTR基因分型技術(shù)檢測結(jié)果

7位點VNTR基因分型技術(shù)檢測結(jié)果表現(xiàn)為高度多態(tài)性，HGI值為0.513～0.786；7位點VNTR基因分型技術(shù)檢測中，QUB11a、QUB-11b、VNTR3820 3個位點屬于高分辨率位點, HGI值分別為0.786、0.672、0.637；其余4個位點QUB-26、QUB-18 、MIRU 26、Mtub21均為中等分辨率位點，HGI值分別為0.583、0.566、0.527、0.513。

三、聚類分析

由圖1 可見，121株MTB經(jīng)聚類分析后，分為3個大的基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群)，81個基因型。其中Ⅰ群占14.9%(18/121)，含15個基因型；Ⅱ群76.9%(93/121)，含59個基因型，說明Ⅱ群為主要流行群；Ⅲ群占8.2%(10/121)，含7個基因型。

圖1 121株MTB菌株的聚類分析圖

由表3 可見，7位點VNTR基因分型技術(shù)檢測結(jié)果將121株MTB菌株分為17個簇和64個單獨基因型，每個簇包括2～14株臨床分離株不等，最大的簇由14株MTB菌株構(gòu)成，所占比較高為11.6%(14/121), 121株MTB菌株中，成簇菌株57株，成簇率為 47.1%(57/121)，近期感染率最小估計值為33.1%(40/121)；其余64株菌株為單獨基因型。

四、患者年齡、性別、初復(fù)治結(jié)核病與121株MTB菌株基因型的關(guān)系

121株MTB菌株經(jīng)聚類分析分為3個大的基因群。按患者年齡、性別及治療分類(初治與復(fù)治)進(jìn)行分組，各組均以Ⅱ群為主，組間差異均未見統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表2 121株MTB對不同抗結(jié)核藥物的耐藥性和VNTR特征分布

表3 121株MTB菌株的基因型分布情況

注近期感染率最小估計值=(nc-c)/n×100%。其中“nc”指成簇的菌株株數(shù)，“c”代表菌株成簇個數(shù)，n代表菌株總數(shù)。成簇率=成簇菌株數(shù)/總菌株數(shù) × 100%

表4 不同人群特征與121株MTB菌株基因型的關(guān)系

注表中括號內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”；a：Fisher精確概率檢驗

討 論

基因分型方法研究結(jié)核病已經(jīng)成為分子流行病學(xué)研究的一個熱點，它能夠初步判斷結(jié)核病傳播相關(guān)危險因素、預(yù)測可能的暴發(fā)流行、追蹤傳染源，以及區(qū)分結(jié)核病患者為內(nèi)源性復(fù)發(fā)和外源性再感染等[6]。

我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，北京基因型是我國的主要流行菌株，通過對 2007 年在全國 31 個省耐藥基線調(diào)查收集的菌株研究結(jié)果顯示，我國62.2%的MTB菌株為北京基因型[7]；該型菌株在我國北方地區(qū)達(dá)到76.5%，南方地區(qū)為 53.2%[8]。本研究結(jié)果顯示，121株結(jié)核分枝桿菌中北京基因型菌株有101株，占83.5%(101/121)；非北京基因型菌株20株占16.5%(20/121)。由此可見，北京基因型菌株也是黑龍江省五常市主要流行株，這與目前大多數(shù)研究一致。

本研究北京基因型菌株和非北京基因型菌株的耐藥率分別為31.7%(32/101)、20.0% (4/20)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；北京基因型和非北京基因型耐多藥率分別為2.0%(2/101)和5.0%(1/20)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。目前許多關(guān)于結(jié)核分枝桿菌在不同省份的分子流行病學(xué)的研究報告均顯示北京基因型占主要的地位，但北京基因型的流行是否會引起結(jié)核病的耐藥目前沒有定論[9-12]。

VNTR 基因分型研究中，位點的選擇很重要。國內(nèi)多個課題組也在探索適合我國MTB流行菌株基因型特點的VNTR組合，但目前不同研究推薦的VNTR組合差異較大，最少僅有3個位點(QUB-11b、QUB26、QUB4156)，最多的有24個位點，至今尚沒有獲得廣泛認(rèn)可的VNTR組合[13]。Zhang等[14]研究 45個 MIRU-VNTR位點在北京基因型菌株中的分型能力, 推薦了 VNTR-7和 VNTR-16位點兩種分型方法；楊洪毅等[15]研究也表明VNTR-7位點與VNTR-16位點比較雖分辨能力略低, 成簇率較高, 但可以節(jié)約成本和縮短時間, 較適用于大規(guī)模調(diào)查或快速檢測的初篩；7位點VNTR基因分型技術(shù)用于北京基因型的分析, 有較高的分辨能力, 操作簡便, 適用于結(jié)核病控制工作中北京家族菌株占優(yōu)勢地區(qū)的分子流行病學(xué)研究。本研究采用了具 有較高分辨率的 7個VNTR 位點基因分型技術(shù)，結(jié)果顯示其對黑龍江省五常市的 MTB 菌株有很高的分辨能力。

分子流行病學(xué)研究中，感染有相同基因型的MTB菌株具有“成簇性”，表明患者可能是近期被同一傳染源所感染；而基因型表現(xiàn)為“唯一性”的未成簇MTB菌株，提示患者發(fā)病可能是由于內(nèi)源性復(fù)燃所致，與周圍環(huán)境的傳播關(guān)系不大。本研究121株菌株中，成簇菌株57株，近期感染率最小估計值為33.1%(40/121)，反映了這些成簇菌株在黑龍江省五常市形成了近期傳播。本研究顯示，121株MTB菌株經(jīng)聚類分析分為3個大的基因群。按患者年齡、性別及治療分類(初治與復(fù)治)進(jìn)行分組，各組均以Ⅱ群為主，組間差異均未見統(tǒng)計學(xué)意義。成簇菌株和耐藥菌株主要分布在Ⅱ群中所占比率最高，分別為49.5%(46/93)和77.8%(28/36)，且Ⅱ群又以北京基因型菌株為多，后續(xù)要重點監(jiān)控和追蹤北京基因型菌株，確定耐藥原因作為研究的重點。

本研究表明，7位點的VNTR基因分型技術(shù)對于黑龍江省五常市具有很好的分辨率，適用于開展對MTB的分子流行病學(xué)研究。后續(xù)研究將圍繞上述菌株進(jìn)行全基因組測序等工作，探究這些菌株傳播的分子生物學(xué)機制。在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量檢測，結(jié)合其他分子生物學(xué)方法進(jìn)一步對黑龍江省流行菌株及其他各型菌株的耐藥性、耐藥基因、耐藥位點進(jìn)行研究，在長期的抗結(jié)核治療過程中，定期有效追蹤 MTB 的藥敏試驗、確定耐藥原因作為研究的重點，這對本地區(qū)有效防控結(jié)核病具有重要意義。