劉曉俊 余楓華 余云芳 紀律 周攀 趙雁林

作者單位：443000 湖北省宜昌市疾病預防控制中心檢驗科(劉曉俊、余楓華、余云芳、紀律、周攀)；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室(趙雁林)

肺結核是由結核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病，又被稱之為“貧困病”，多發(fā)于衛(wèi)生條件差的貧困地區(qū)。據(jù)WHO報道2017年全球肺結核死亡患者達到160萬例，其中HIV陰性肺結核患者死亡130萬例，HIV陽性患者死亡30萬例[1]。結核病仍然是全球頭號傳染病，嚴重威脅人類健康。我國結核病疫情存在高感染率、高復發(fā)率、高耐藥率、低發(fā)現(xiàn)率的特點[2]。追蹤傳染源、搞清楚其傳播途徑、識別重點人群是結核病防控中重要的幾個環(huán)節(jié)。隨著近年來分子生物學的發(fā)展，特別是基因分型技術在分子流行病學中的應用，人們在應對傳染病疫情時有更多快速可靠有效的找到傳染源確定傳播方式的方法。

結核分枝桿菌散在分布重復單位及可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(MIRU-VNTR)分型方法，由于其具有操作簡單、重復性好、分辨率高且易于實驗室間比對的特點[3-5]，被廣泛應用于進行結核分枝桿菌基因分型的研究中。筆者以宜昌地區(qū)2016年12月至2017年5月收集的367株結核分枝桿菌臨床分離株為研究對象，運用VNTR-MIRU技術對其進行基因分型，探討菌株的遺傳多樣性、成簇性及傳播率，為宜昌地區(qū)的結核病防治工作提供科學依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

2016年12月至2017年5月367株結核分枝桿菌臨床分離株由宜昌市疾病預防控制中心分離獲得，后送往中國疾病預防控制中心結核參比室代為傳代培養(yǎng)、鑒定及保存。標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心結核參比室提供。367株菌株分離來自367例患者，其中初治患者321例，復治患者46例。

二、實驗方法

1. 主要試劑和儀器：2x Taq MasterMix (Dye)(北京康為世紀生物科技有限公司)、GoldenView(北京艾德萊生物科技有限公司)、引物(廣州天一輝遠基因科技有限公司)、DNA Maker(北京塞百盛基因科技有限公司)、瓊脂糖(北京塞百盛基因科技有限公司)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)、PCR擴增儀(杭州博日科技公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2. 位點選擇:選擇國際通用的24位點[6]VNTR-MIRU基因分型方法，引物由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。

3. 核酸的制備：將收集到的菌株接種于自制的羅氏培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2～4周，刮取1～2環(huán)結核分枝桿菌，置于裝有500 μl TE的離心管中，渦旋混勻100 ℃金屬浴30 min，滅活后將其超聲裂解(300 W)，最后采用離心機16 200×g離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4. PCR擴增體系及條件：擴增反應在25 μl 體系中進行，其中12.5 μl 2× Taq Master Mix (Dye)，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板1.5 μl，三蒸水補平至反應體積。PCR反應條件：(1) 94 ℃預變性2 min；(2) 94 ℃變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；(3)72 ℃終延伸10 min；(4) 4 ℃保存。

5. 電泳檢測：取8 μl擴增好的PCR產(chǎn)物，按照電場強度8 V/cm設置電壓，在2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min.，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果，以DNA Marker為參照記錄片段的大小(bp數(shù))。

6. 成簇性分析：將擴增到的片段數(shù)字化，每個位點的拷貝數(shù)等于產(chǎn)物長度減去側翼序列的長度，然后除以單個重復單元的序列長度，得到重復拷貝數(shù)。2株或者2株以上的結核分枝桿菌如果所有位點的拷貝數(shù)都一致，就認為形成了1個簇，成簇率計算公式為：nc/n；傳播率計算公式為[21]：(nc-c)/n×100%；其中c為簇數(shù)目，nc代表成簇的菌株總數(shù)，n代表總菌株數(shù)。將每一株結核分枝桿菌分離株在相應的位點拷貝數(shù)記錄下來，導入到BioNumerics 5.0軟件，進行成簇性分析。

7. 位點評價：用Excel處理和分析數(shù)據(jù)。位點的遺傳差異性值h由下面公式計算獲得[7]：

其中xi為某一特定基因的頻率，n為總分離株數(shù)。

總分辨率和各點的分辨率：用Hunter-Gaston指數(shù)(HGI)來衡量，其計算公式如下[8]：

其中，n為總的菌株數(shù)，s為獲得的基因型總數(shù)，nj為某基因型的菌株數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。所有假設檢驗均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、PCR擴增情況

對367株結核分枝桿菌采用24位點的VNTR-MIRU位點重復序列的PCR擴增，采用24個位點的重復序列進行PCR擴增，得到了24位點完整的瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)，通過判讀電泳條帶的大小，計算每個位點的重復拷貝數(shù)以獲取基因分型的數(shù)據(jù)。

不同菌株在同一位點上的拷貝數(shù)(表1)差異提示該位點的遺傳多樣性大小。在同一位點的不同拷貝數(shù)越多，表明該位點的等位基因表現(xiàn)了很強的差異性。如分析QUB11b這個位點，就發(fā)現(xiàn)它有1、2、3、4、5、6、7、9共計8個不同類型的拷貝數(shù)；而有的位點如MIRU24，僅僅只有1個類型的拷貝數(shù)，表明其遺傳多樣性小。

二、遺傳多樣性及分辨率

24位點的MIRU-VNTR檢測結果表現(xiàn)出了明顯的遺傳多樣性(表2)，各個位點的等位基因的多態(tài)性(h值)在0.03～0.79間變化，最小的MIRU24為0.03，最大的QUB11b為0.79。

24個組合位點的結核分枝桿菌的總分辨率(HGI值)為0.999，計算各位點的HGI值的大小順位為：QUB11b=Mtub21>MIRU26>Mtub04>QUB26>MIRU31>QUB4156>MIRU40=MIRU10>ETRA=MIRU39>MIRU16>Mtub30>MIRU04>ETRB>MIRU27>Mtub39>MIRU23>ETRC>MIRU02>MIRU24。其中分辨率大于0.6的高分辨位點[9]有5個，分別為QUB11B、Mtub21、MIRU26、Mtub04及QUB26；分辨率在0.3～0.6之間的中分辨率位點有6個，小于0.3的低分辨率位點13個。

表1 367株結核分枝桿菌24位點VNTR重復拷貝數(shù)分布(株)

注 圖1a M為Marker Ⅱ，2泳道為H37Rv陽性對照，3～10泳道為部分結核分枝桿菌在ETRC位點上的PCR產(chǎn)物；圖1b M為Marker Ⅱ，2泳道為H37Rv陽性對照，3-10泳道為部分結核分枝桿菌在QUB11b位點上的PCR產(chǎn)物；圖1c M為Marker Ⅱ，2泳道為H37Rv陽性對照，3～9泳道為部分結核分枝桿菌在MIRU02位點上的PCR產(chǎn)物；圖1d M為Marker Ⅱ，2泳道為H37Rv陽性對照，3～9泳道為部分結核分枝桿菌在MIRU27位點上的PCR產(chǎn)物圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 24位點的多態(tài)性及分辨率

續(xù)表2

圖2 367株結核分枝桿菌株聚類分析圖

三、指紋圖譜

對367株結核分枝桿菌采用MIRU-VNTR檢測的結果進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)其基因型呈明顯的多態(tài)性(圖2)，總共有324個基因型。成簇性分析發(fā)現(xiàn)其中90株菌株形成39個簇，成簇率為24.52%，而未成簇僅形成“唯一”類別的共計285株。在成簇菌株中(圖3)，分別有2株成簇、3株成簇、4株成簇、5株成簇等4種類型；其中最大的簇為5株成簇，成簇率為5.56%。根據(jù)傳播率計算公式計算出367例患者的近期傳播率為13.90%(51/367)。

圖3 90例成簇菌株成簇株數(shù)分布

四、成簇型和獨特型結核分枝桿菌與初治、復治患者的相關性分析

本研究將367株結核分枝桿菌分為成簇型和唯一型，分別為90株(24.52%，90/367)和277株。其中復治患者46株，成簇型10株，成簇率(21.74%，10/46)；初治患者321株，成簇型80株，成簇率(24.92%，80/321)。經(jīng)χ2檢驗，成簇菌株和獨特型菌株在初治患者和復治患者中差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

討 論

隨著近些年分子生物學的飛速發(fā)展，分子流行病學在結核病的應用也越來越廣泛，比如結核病的暴發(fā)和流行、傳染源的尋找和追蹤、內源性復燃和近期外源性感染的鑒別，以及耐藥菌株的傳播和實驗室污染等。結核病分子分型常用的方法包括IS6110限制性片段長度多態(tài)性(IS6110-RFLP)、間隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)、VNTR-MIRU，以及最近發(fā)展起來的二代全基因組測序(WGS)等。這些分型方法通常以IS6110-RFLP為金標準[10]。IS6110-RFLP由于其具有分辨率高、可比性好的特點，自從1993年以來已被廣泛應用在結核分枝桿菌分子分型當中；但是IS6110-RFLP的缺點同樣明顯：對實驗室技術能力要求較高、費用較大、耗時較長、菌株量要求大，且不同實驗室做出來的數(shù)據(jù)較難進行比較等。Spoligotyping與IS6110-RFLP比較，雖然有耗時短、所需要DNA量小、且實驗室間比對容易等優(yōu)點，但是其分辨率卻不理想，較IS6110-RFLP差；且對于某些廣泛流行的菌株，特別是在我國乃至全世界流行的北京家族株的分型能力較差[11]。WGS是一種最新的基因分型方法，它相對于傳統(tǒng)的分型方法具有高通量、高效率且能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)成簇菌株之間的差異、分成更小的簇，以及準確鑒別傳播發(fā)生的路徑順序和是否存在多個傳染源等優(yōu)點；雖然隨著二代測序的發(fā)展，WGS較一代成本已經(jīng)明顯下降，但是相對于傳統(tǒng)分子分型方法成本還是要高很多，且數(shù)據(jù)分析處理較為復雜，需要較強的數(shù)據(jù)處理能力[12-13]。VNTR-MIRU是一種利用PCR方法擴增結核分枝桿菌衛(wèi)星DNA側翼序列間重復拷貝單元，然后對拷貝數(shù)進行數(shù)字化編碼，再通過相關軟件對這一串數(shù)字編碼進行分析然后得到相應分型結果的過程。其操作簡單、成本低、重復性好，且所得結果可比性好，分辨率與IS6110-RFLP幾乎相當，因此被美國疾病預防控制中心推薦為結核分枝桿菌分型的首選方法[14]。van Dentekom等[15]認為，在分析近期結核分枝桿菌傳播時MIRU-VNTR比IS6110-RFLP更合適。

表3 初治與復治患者菌株成簇率比較

注“成簇菌株數(shù)”小括號內數(shù)值為“成簇率(%)”

VNTR-MIRU目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了可以被選擇的多個多態(tài)性位點，不同的位點分辨率差異較大，且同一位點在不同的研究中分辨率差異也較大，因此選擇合適的位點組合對于進行更好的基因分型至關重要。世界各地的學者都在探索最優(yōu)的位點組合，常見的位點組合有12位點、15位點和24位點。通常認為15位點和24位點的組合更接近IS6110-RFLP的分辨率[16]。本研究選用國際上通用的24位點進行VNTR-MIRU分型。結果提示24位點的HGI達到0.99997，分型效果較好。各位點的分辨率不同，HGI變化范圍為0.03～0.73，其中QUB11B、Mtub21、MIRU26、Mtub04、QUB26 等5個位點的分辨率較高，提示位點的進化較快、多態(tài)性高，這與陳志等[17]對四川省綿陽地區(qū)結核分枝桿菌基因分型的結果基本一致。

此次研究對宜昌地區(qū)367株結核分枝桿菌臨床分離株進行分析，發(fā)現(xiàn)其共有324個基因型，呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。成簇性分析得到其成簇率為24.52%，低于西班牙、英國等國家報道的(36.6%～54%)成簇率[18-19]，與2014年徐貴生[20]調查的江蘇連云港地區(qū)的19.54%成簇率較為接近。本研究對初、復治患者進行了與成簇率相關性的比較，結果表明宜昌地區(qū)成簇型和獨特型菌株在初治和復治患者之間差異無統(tǒng)計學意義，提示近期傳播致病的傳播率初治和復治患者相當，該結果與張志等[21]對邢臺地區(qū)結核分枝桿菌復治患者的成簇率顯著高于初治患者的成簇率的結果不一致；筆者分析這可能與本次研究收集的菌株數(shù)量不夠大、時間比較集中，且無法拿到復治患者初次發(fā)病時的痰液標本有關。 筆者認為，結核分枝桿菌成簇率可反應該地區(qū)的近期流行情況，成簇率越高提示近期流行較高，反之非成簇患者則可能為既往感染的內因復燃所致。本研究表明，宜昌地區(qū)結核病患者以既往感染的內因復燃為主，致病病原間有較高的遺傳多樣性；同時又提示存在一定的成簇比例，而成簇率與傳播率相關。本次研究中近期傳播率為13.90%，提示本地區(qū)存在結核分枝桿菌近期傳播風險，應當在結核病防治過程中加強監(jiān)測。