劉艷紅 陳文霞 屈重行 李琨琨 姜媛媛 吳慧麗

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科(450007)

背景：長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)來參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，但lncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制尚未闡明。目的：探討lncRNA SOX21-AS1通過調(diào)控微小RNA-202-5p(miR-202-5p)的表達(dá)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)過程的分子機(jī)制。方法：以SOX21-AS1小分子干擾RNA(si-SOX21-AS1)、miR-202-5p模擬物及其抑制劑轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞株SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況，雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測SOX21-AS1與miR-202-5p的靶向調(diào)控關(guān)系，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞周期蛋白1(cyclin D1)、MMP-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：結(jié)直腸癌細(xì)胞中SOX21-AS1 mRNA表達(dá)顯著高于人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞(P<0.05)，miR-202-5p mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。沉默SOX21-AS1或上調(diào)miR-202-5p表達(dá)可顯著抑制HCT116、SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，并可抑制cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05)。SOX21-AS1可靶向結(jié)合miR-202-5p，并可負(fù)向調(diào)控miR-202-5p的表達(dá)和活性；抑制miR-202-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默SOX21-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結(jié)論：沉默SOX21-AS1表達(dá)可通過上調(diào)miR-202-5p的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，腫瘤生長、惡性進(jìn)展是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[1]。目前臨床多采用手術(shù)、靶向治療、免疫治療等手段治療結(jié)直腸癌，但患者的預(yù)后較差[2]。既往研究顯示癌基因的激活或抑癌基因的失活等可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性轉(zhuǎn)移[3]。目前結(jié)直腸癌的致病機(jī)制尚未完全闡明，需進(jìn)一步探究結(jié)直腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在不同疾病中的表達(dá)趨勢不同，可參與細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程，有研究表明lncRNA SOX21-AS1可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[4]。SOX21-AS1還可通過競爭性結(jié)合微小RNA-7(microRNA-7, miR-7)來促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展[5]。但SOX21-AS1在結(jié)直腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制尚未完全闡明。通過DIANA預(yù)測發(fā)現(xiàn)SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列。有研究表明miR-202-5p通過直接靶向SMARCC1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用[6]。LncRNA NORAD通過抑制miR-202-5p表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[7]。本研究通過在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中沉默SOX21-AS1表達(dá)或上調(diào)miR-202-5p表達(dá)，旨在驗(yàn)證SOX21-AS1對miR-202-5p表達(dá)的調(diào)控作用，從而探討SOX21-AS1調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料與試劑

人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、SW620、LoVo、HT29購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；SOX21-AS1小分子干擾RNA(si-SOX21-AS1)、無意義陰性序列(si-con)、miR-202-5p模擬物(mimics)、陰性對照(miR-con)、miR-202-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-202-5p)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠均購自美國Corning公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallopro-teinases-2, MMP-2)單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

二、方法

1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：所有細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液接種于24孔板，待細(xì)胞生長融合至70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，隨機(jī)分為NC組(未經(jīng)任何處理的細(xì)胞)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con的細(xì)胞)、si-SOX21-AS1組(轉(zhuǎn)染si-SOX21-AS1的細(xì)胞)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con的細(xì)胞)、miR-202-5p組(轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimics的細(xì)胞)、si-SOX21-AS1+anti-miR-con組(共轉(zhuǎn)染si-SOX21-AS1與anti-miR-con的細(xì)胞)、si-SOX21-AS1+anti-miR-202-5p組(共轉(zhuǎn)染si-SOX21-AS1與anti-miR-202-5p的細(xì)胞)，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2. 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA表達(dá)：收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SOX21-AS1正向引物：5’-TTT GCT TTC GAG CTA TGA-3’，反向引物：5’-CTT AAT TGC CTG ATA CGC-3’；GAPDH正向引物：5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’，反向引物：5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3’；miR-202-5p正向引物：5’-ACA CTC CAG CTG GGT TCC TAT GCA TAT A-3’，反向引物：5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GT-3’；U6正向引物：5’-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3’，反向引物：5’-GGA ACG CTT CAC GAT TTG-3’，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，參照試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min(循環(huán)1次)；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(循環(huán)40次)。SOX21-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-202-5p則以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOX21-AS1、miR-202-5p mRNA相對表達(dá)量。

3. MTT法檢測細(xì)胞增殖：收集各組對數(shù)生長期結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個/mL，按照每孔200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)向每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10 min，上酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處各孔吸光度值(A值)。

4. 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：分別取各組對數(shù)生長期結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，室溫條件下1 000 r/min離心6 min(離心半徑6 cm)，棄上清，預(yù)冷PBS清洗，加入500 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

5. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：取對數(shù)生長期結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，按照每孔200 μL將細(xì)胞懸液接種于24孔板Transwell小室的上室。取600 μL培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)加入Transwell小室的下室，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦拭未遷移細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

6. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲：以預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(稀釋比例為9∶1)，24孔板Transwell小室上室每孔加入40 μL Matrigel稀釋液，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。取對數(shù)生長期結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，按照每孔200 μL單細(xì)胞懸液Transwell小室的上室，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌3次×5 min，多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦去未侵襲細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

7. 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測：將螢光素酶報(bào)告載體SOX21-AS1-WT、SOX21-AS1-MUT分別與miR-202-5p mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，根據(jù)螢光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞相對螢光素酶活性。分別將si-con、si-SOX21-AS1、pcDNA、pcDNA-SOX21-AS1轉(zhuǎn)染各組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-202-5p mRNA表達(dá)。

8. 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組cyclin D1、MMP-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)：收集各組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白高溫變性，取30 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫條件下孵育一抗(稀釋比例為1∶1 000)，搖床孵育過夜，TBST洗滌3次×15 min，孵育二抗(稀釋比例為1∶2 000)，搖床孵育1 h，TBST洗滌3次×15 min，曝光，顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)，并應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SOX21-AS1和miR-202-5p在人結(jié)直腸癌細(xì)胞和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460相比，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW480、SW620、LoVo、HT29中SOX21-AS1表達(dá)顯著升高，miR-202-5p表達(dá)顯著降低(圖1)。其中SOX21-AS1在結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中的表達(dá)較其他細(xì)胞株明顯升高，miR-202-5p在結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中的表達(dá)相對較低，因而選用結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞為研究對象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*與NCM460細(xì)胞比較，P<0.05

圖1人結(jié)直腸癌細(xì)胞和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中SOX21-AS1、miR-202-5p表達(dá)(qRT-PCR法)

二、沉默SOX21-AS1表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響

與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中SOX21-AS1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05；圖2A、2B)，提示轉(zhuǎn)染成功。與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05；圖2C、2D)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05；圖2E-2H)，cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖2I-2K)；而si-con組上述指標(biāo)與NC組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

*與si-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測SOX21-AS1 mRNA表達(dá)；C-D：MTT法檢測細(xì)胞活力；E-H：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；I-K：蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclin D1和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 沉默SOX21-AS1表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

三、沉默SOX21-AS1表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與si-con組相比，si-SOX21-AS1組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；而si-con組上述指標(biāo)與NC組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖3)。

*與si-con組比較，P<0.05

圖3 沉默SOX21-AS1表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞遷移和侵襲的影響

四、SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-202-5p表達(dá)

通過DIANA預(yù)測到SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列(圖4A)。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染克隆有SOX21-AS1-3’UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-202-5p組與miR-con組螢光素酶活性相比無明顯差異；轉(zhuǎn)染克隆有SOX21-AS1-3’UTR野生型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-202-5p組螢光素酶活性顯著低于miR-con組(P<0.05；圖4B、4C)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示si-SOX21-AS1組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中miR-202-5p mRNA表達(dá)顯著高于si-con組(P<0.05)，pcDNA-SOX21-AS1組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中miR-202-5p表達(dá)顯著低于pcDNA組(P<0.05；圖4D、4E)。

*與miR-con組比較，P<0.05；#與si-con組比較，P<0.05；▲與pcDNA組比較，P<0.05

A：SOX21-AS1與miR-202-5p存在靶向序列；B-C：螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D-E：結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480中miR-202-5p表達(dá)

圖4 SOX21-AS1靶向調(diào)控miR-202-5p的表達(dá)

五、MiR-202-5p模擬物對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-202-5p組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中miR-202-5p mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖5A、5B)，提示轉(zhuǎn)染成功。與miR-con組相比，miR-202-5p組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖5C-5K)。

*與miR-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測miR-202-5p mRNA表達(dá)；C-D：MTT法檢測細(xì)胞活力；E-F：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲；G-H：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；I-K：蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclin D1、MMP-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖5 MiR-202-5p模擬物對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

六、MiR-202-5p抑制物部分逆轉(zhuǎn)沉默SOX21-AS1對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

與si-SOX21-AS1+anti-miR-con組相比，si-SOX21-AS1+anti-miR-202-5p組結(jié)直腸癌HCT116、SW480細(xì)胞中miR-202-5p mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05；圖6)。

*與si-con組比較，P<0.05；#與si-SOX21-AS1+anti-miR-con組比較，P<0.05

A-B：qRT-PCR法檢測miR-202-5p表達(dá)；C-D：MTT法檢測細(xì)胞活力；E-F：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲；G-H：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；I-K：蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclin D1、MMP-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖6 抑制miR-202-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默SOX21-AS1對結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

討 論

LncRNA可通過與miRNA、lncRNA-蛋白相互作用等多種機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，既往研究顯示部分lncRNA在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)并可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來參與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡等過程[8-10]。因此本研究積極探尋lncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制，對提高臨床治療效果以及改善患者預(yù)后均具有重要意義。

有研究[11]顯示SOX21-AS1在腎母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞增殖。SOX21-AS1表達(dá)升高可預(yù)示肺腺癌、肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良[12-13]。但SOX21-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中SOX21-AS1表達(dá)均顯著升高，表明SOX21-AS1在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，沉默SOX21-AS1表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示沉默SOX21-AS1表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制癌癥進(jìn)展。有研究表明cyclin D1可正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞生長；細(xì)胞接收凋亡信號時(shí)可激活線粒體凋亡途徑，激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子caspase-3形成cleaved caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞外基質(zhì)降解可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，其中MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究結(jié)果顯示沉默SOX21-AS1表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中cyclin D1、MMP-2表達(dá)，并促進(jìn)cleaved caspase-3表達(dá)，提示沉默SOX21-AS1表達(dá)可能通過上調(diào)cleaved caspase-3和下調(diào)cyclin D1、MMP-2表達(dá)，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程。

MiR-202在肺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，可通過抑制下游靶基因GLI-2表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡過程[17]。LncRNA NORAD可通過靶向miR-202-5p促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展[18]。研究表明miR-202-5p可通過靶向ROCK1抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-202-5p表達(dá)顯著降低，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)miR-202-5p表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX21-AS1可靶向調(diào)控miR-202-5p表達(dá)，抑制miR-202-5p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)沉默SOX21-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，說明沉默SOX21-AS1可通過上調(diào)miR-202-5p表達(dá)來改善結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。提示SOX21-AS1有望作為結(jié)直腸癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，SOX21-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默SOX21-AS1表達(dá)可通過上調(diào)miR-202-5p表達(dá)進(jìn)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過程，SOX21-AS1可通過負(fù)向調(diào)控miR-202-5p的表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展，可為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新方向。但結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素的復(fù)雜過程，關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中miR-202-5p對下游靶基因和其他相關(guān)信號通路的調(diào)控作用仍需行進(jìn)一步探討。