王婉麗, 袁慶葉,2 , 董必成, 高俊琴, 韓廣軒, 于飛海,4,5,*

1 北京林業(yè)大學自然保護區(qū)學院, 北京 100083 2 北京農業(yè)職業(yè)學院國際教育學院, 北京 102442 3 中國科學院煙臺海岸帶研究所中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室, 煙臺 264003 4 臺州學院濕地生態(tài)學與克隆生態(tài)學研究所, 臺州 318000 5 臺州學院植物進化生態(tài)學與保護浙江省重點實驗室, 臺州 318000

自然界中的許多植物是具有無性繁殖能力的克隆植物,并且克隆植物在很多群落如草原、草甸、凍原、苔原、竹林和濕地等占據(jù)優(yōu)勢地位,影響著這些群落的結構和功能[1- 4]?？寺≈参锟梢酝ㄟ^匍匐莖、根狀莖和水平根等橫生結構實現(xiàn)相連分株之間物質、能量以及信號等的傳遞和共享[5],這種現(xiàn)象稱為克隆整合[6- 7]?？寺≌弦话阃ㄟ^示蹤物質(如同位素和染料)的傳輸來直接表征,或者通過其對分株生長、形態(tài)和生理等的影響來間接體現(xiàn)[5]。大量研究表明,克隆整合可以顯著改變植物的生長、形態(tài)和生理特征[8- 10],提高克隆植物適應逆境和耐受脅迫的能力[8- 9],增強外來植物的入侵性[10-13]。例如,克隆整合可以提高沙地克隆植物沙鞭(Psammochloavillosa)對流沙掩埋[14]和風蝕[15]的耐受力,提高水陸兩棲克隆植物空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)對水淹的耐受力[16- 17],以及提高水陸兩棲克隆植物雙穗雀稗(Paspalumpaspaloides)對重金屬脅迫的耐受力[18]等。

克隆整合對克隆植物生長和脅迫耐受力的影響將可能進一步對分株周圍生物和非生物的環(huán)境因子產生影響,但相關的研究卻十分有限,且研究結果并不一致[19- 21]。研究表明,克隆整合可以影響活血丹(Glechomalongituba)根際土壤的有機碳含量、碳和氮有效性、氮的礦化和硝化速率、脲酶和蔗糖酶活性以及土壤微生物總磷酸脂肪酸(PLFA)含量[19],并可以改變遮蔭白夾竹(Phyllostachysbissetii)根際土壤的胞外酶活性和功能基因的豐度[21]。然而,袁慶葉等[20]對黃河三角洲蘆葦濕地的研究卻發(fā)現(xiàn),克隆整合對土壤微生物群落的總PLFA含量、各主要類群的PLFA含量、土壤微生物碳和氮含量均無顯著的影響。此外,國內外尚未開展有關克隆整合對分株周圍土壤團聚體組成特征影響的研究。

濱海濕地是海陸交錯的重要地帶,一方面直接或間接為人類提供淡水、生物、礦產等重要物資,另一方面也是礦物質、營養(yǎng)物質和有機有毒物質凈化的重要場所[22]。近年來,隨著近海和沿海石油開采活動的增加,石油在開采、加工和集運過程中泄露問題頻發(fā),嚴重影響濱海濕地的安全與生態(tài)系統(tǒng)服務和功能[23]。黃河三角洲作為我國暖溫帶典型的濱海濕地生態(tài)系統(tǒng),同樣遭受石油污染的影響,而石油污染也已成為黃河三角洲地區(qū)濕地生態(tài)系統(tǒng)退化的主要因子之一[24- 25]。

石油主要由碳和氫兩種元素組成[26],包含烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴三大類有機化合物[27],以及銅(Cu)、鋅(Zn)、鉛(Pb)、磷(P)等許多元素[28]。石油復雜的有機混合物成分不僅能夠毒害植物的生長[29- 30],而且也會改變土壤理化性質[23]。例如,石油進入環(huán)境后,會增加土壤中有機質的含量,其反應基可以與無機氮、磷結合并限制其硝化和脫磷酸作用,使得N、P等營養(yǎng)元素不足,導致土壤中的C/N、C/P和 N/P失調[31]。同時,石油污染土壤后,還可能改變土壤pH值、持水率、透氣性等[32]。此外,石油帶來的污染并非總是均勻的,在野外情況下常常形成大小不等的石油污染斑塊,而克隆植物的相連分株可以從遭受石油污染的斑塊擴展到無石油污染的斑塊或者相反。目前有關濱海濕地石油污染的研究較多,但國內外尚缺乏有關克隆整合對石油污染后的土壤理化屬性影響的研究。由于克隆整合可以提高受脅迫分株的耐受能力,因此預測,克隆整合可能削弱石油污染對分株周圍土壤理化性質的影響。

以根狀莖型克隆植物——蘆葦(Phragmitesaustralis(Cav.)Trin. ex Steudel)為單優(yōu)群落的黃河三角洲濱海濕地為對象,開展了一個為期3年的野外實驗,以探究克隆整合和石油污染對蘆葦濕地土壤理化性質的影響。在蘆葦濕地內設置36個圓形樣方,每年向樣方添加0、5或10 mm的原油,用于模擬無污染、輕度和重度石油污染。同時,通過保持或切斷樣方內外蘆葦分株間的根狀莖來控制克隆整合的有或無。通過本實驗,我們擬回答兩個科學問題：(1)石油污染如何影響蘆葦濕地的土壤理化性質？(2)石油污染條件下,蘆葦?shù)目寺≌鲜欠衲軌驕p弱石油污染對土壤理化性質的影響？

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

本研究在中國科學院煙臺海岸帶研究所濱海濕地生態(tài)試驗站內(37°45′36.62″—37°46′15.56″N,118°58′38.74″—118°58′58.77″E)開展,該試驗站位于山東省東營市黃河三角洲(圖1)。試驗站所在地為季節(jié)性濕地,屬于溫帶大陸性季風氣候,冷熱干濕界限明顯。每年70%的降水分布在5—9月份,年平均降水量為551.6 mm[33]。年均氣溫為12.9℃,年均蒸發(fā)量為1962 mm[34- 35]。研究區(qū)淡水缺乏,土壤為隱域性潮土和鹽堿土,并向積鹽方向發(fā)展。該試驗站優(yōu)勢物種為蘆葦、伴生有白茅(Imperatacylindrica(L.)Beauv.)、鵝絨藤(CynanchumchinenseR. Br.)和鹽地堿蓬(Suaedasalsa(Linn.) Pall.)等。

圖1 黃河三角洲及試驗站地理位置Fig.1 The geographical location of the Yellow River Delta and the research station

1.2 實驗設計

在試驗站布設6個區(qū)組,各區(qū)組的植被群落組成、蘆葦生長狀況和分株數(shù)量相對一致。每個區(qū)組內包含6個直徑為60 cm的圓形樣方,樣方間距在2 m以上。應用析因設計對樣方進行設置,包括克隆整合(有和無)和石油污染(無污染、輕度或重度污染)兩個因子。通過對圓形樣方內外蘆葦根狀莖的物理切斷與否來實現(xiàn)克隆整合的有或無。為此,我們將直徑60 cm、高35 cm的PVC管穿過蘆葦植株后垂直插入地面以下5 cm,作為根狀莖連接處理(即不阻斷克隆整合),而將直徑和高均為60 cm的PVC管垂直插入到地面以下30 cm,作為蘆葦根狀莖切斷處理(即阻斷克隆整合)。預實驗表明,研究區(qū)內的蘆葦根狀莖主要分布在地表以下15—20 cm處。因此,前者不影響樣方內外蘆葦根狀莖的連接,而后者可以有效切斷樣方內外絕大部分蘆葦根狀莖的連接。兩種根狀莖處理中PVC管的地表以上部分均為30 cm,以保證PVC管對不同處理的影響一致性和防止石油溢出。石油污染水平分別為每年添加0、5和10 mm厚的原油,原油來源于勝利油田；分別在2014年6月29日、2015年5月13日和2016年5月11日向處理樣方內進行均勻添加,石油添加過程中避免接觸樣方中的植物地上部分。石油添加后逐漸滲入土壤,土壤表面無殘存的石油塊狀物。每個區(qū)組的6個樣方被分別隨機安排一個處理,即每個區(qū)組均包含6個處理,共計36個樣方。從2014年6月28日布設樣方到實驗結束,共持續(xù)3年。

1.3 測定方法

2016年10月25日,采用土鉆法對每個圓形樣方內土壤進行采集。用內徑為3 cm的土鉆在圓形樣方內采集3個0—20 cm的平行樣后充分混勻作為一個土壤樣品,去除土樣中可見的雜物、植物根系和大型土壤動物等,經自然風干后用于土壤理化性質的測定。每個土樣被分為兩部分,一部分土壤保持原狀用于土壤團聚體組成的測定,另一部分土壤研磨過1 mm篩后用于其他指標的測定。

土壤團聚體采用濕篩法測定,分為4個級別[36- 37]：粗大團聚體(>2.0 mm)、細大團聚體(0.25—2.0 mm)、微團聚體(0.053—0.25 mm)和粉黏團聚體(<0.053 mm)。土壤pH值和電導率分別用pH計測定和電導儀測定(土∶水=1∶5)。土壤總碳和有機碳用總有機碳分析儀(Multi3100 N/C,耶拿分析儀器股份公司,德國)固體模塊測定；土壤總氮經濃硫酸消煮后用連續(xù)流動分析儀(AutoAnalyzer 3,Seal,德國)測定；土壤總磷采用酸溶-鉬銻抗比色法測定。土壤理化性質測定的具體操作方法參照南京農業(yè)大學所編《土壤農化分析》[38]和中國土壤學會所編《土壤農業(yè)化學分析方法》[39]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對測定結果進行數(shù)據(jù)處理與分析,為滿足數(shù)據(jù)的正態(tài)性,對電導率、總碳、C/P和N/P進行了正弦值轉換,并對有機碳和微團聚體(0.053—0.25 mm)分別進行平方根和自然對數(shù)轉換。采用雙因素方差分析(Two-way ANOVAs)探討克隆整合(有和無)和石油添加水平(0、5、10 mm)對土壤團聚體組成、pH值、電導率、總碳、總氮、總磷、有機碳及其比值的影響。

2 結果

2.1 克隆整合和石油污染對土壤團聚體組成的影響

石油添加顯著影響了土壤團聚體組成(表1)。隨著石油添加量的增加,粗大團聚體(>2 mm)的比例顯著增大(從5.0%—7.2%到27.6%—31.8%),而微團聚體(0.053—0.25 mm)的比例顯著降低(從23.4%—23.5%到14.5%—14.8%；表1,圖2)。蘆葦?shù)目寺≌霞捌渑c石油添加的交互作用對土壤團聚體各部分組成均無顯著效應(表1,圖2)。

表1 石油添加水平和蘆葦根狀莖切斷情況對土壤團聚體組成的影響

nsP≥0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

圖2 不同石油添加和根狀莖切斷處理下的土壤團聚體組成 Fig.2 The aggregate composition of the soil under different crude oil addition and rhizome severance treatments

2.2 克隆整合和石油污染對土壤pH值和電導率的影響

石油添加和克隆整合均顯著影響土壤pH和電導率,兩者的交互作用對電導率有顯著效應,而對pH值無顯著效應(表2)。所有處理的土壤樣品pH值均大于8(8.033—8.403),表明實驗地土壤為堿性；所有土樣的電導率均在0.60 mS/cm(0.60—1.63 mS/cm)以上,表明實驗地土壤屬于鹽漬化土壤。與對照組相比,隨著石油添加量的增大,土壤pH值隨之增大,而電導率隨之減小(圖3)。無論石油添加水平如何,蘆葦根狀莖切斷處理的土壤pH值比連接處理大,電導率則表現(xiàn)為切斷處理小于連接處理(圖3)。

圖3 不同石油添加和根狀莖切斷處理下的土壤pH值和電導率Fig.3 Soil pH and electric conductivity under different oil addition and rhizome severance treatments柱體和豎直線分別代表均值和標準差

2.3 克隆整合和石油污染對土壤碳、氮和磷含量的影響

在所有的土壤C、N和P指標中,石油添加僅顯著影響了土壤有機碳和總氮含量,而克隆整合僅對N/P有顯著效應(表3)。兩者的交互作用對各土壤C、N和P含量、C/N、C/P和N/P沒有顯著效應(表3)。與對照組相比,土壤有機碳和總氮含量隨石油添加量的增加而增大；蘆葦根狀莖連接時的土壤N/P比切斷時高(圖4)。

3 討論

本研究結果表明,遭受不同石油添加處理的蘆葦濕地,其土壤理化性質差異顯著。石油添加主要改變了土壤團聚體組成、pH、電導率、土壤有機碳和總氮含量。與對照組相比,兩個石油添加水平下粗大團聚體分別平均增加了57.1%(5 mm厚石油處理)和79.6%(10 mm厚石油處理),而微團聚體分別平均減小了29.6%(5 mm厚石油處理)和59.8%(10 mm厚石油處理)。土壤團聚體組成的改變可能是由于土壤顆粒團聚作用導致的,構成更多粗大團聚體。以往的研究表明石油的高粘度性易導致土壤結塊,阻礙土壤氣體交流,造成土壤的厭氧環(huán)境[40]。此外,本研究實驗地的土壤為鹽堿土,添加石油后土壤的pH增大,電導率減小。土壤pH會影響土壤營養(yǎng)鹽有效性,即當土壤pH過高時,部分營養(yǎng)元素會難以溶解,有效性降低[41]。類似的,隨著土壤石油烴的增加,莫莫格濕地的土壤pH值也顯著增加[42]。石油污染后土壤pH的增大的原因可能有兩個。一方面,石油具有疏水性,這可能導致受污染土壤表層和地下層的潛在干旱,從而加劇土壤的鹽漬化,進而增大了pH值[43]。另一方面,土壤石油污染與交換性酸(TEA,total exchangeable acidity,如H+、Al3+等)的減小,交換性鹽基(TEB,total exchangeable bases,如Ca2+、Na+、Mg2+、K+等)和有效陽離子交換量(ECEC,effective cation exchange capacity)的積累有關[44- 46]。這些機制可能導致石油污染土壤pH值的增大。土壤電導率隨石油添加量的增大而減小,這可能是石油進入土壤后影響了離子的穩(wěn)定性,從而導致電導率的降低[46]。

表2 石油添加水平和蘆葦根狀莖切斷情況對土壤pH值和電導率(EC)的影響

nsP≥0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

表3 石油添加水平、蘆葦根狀莖切斷情況對土壤碳、氮和磷及其比率的影響

Table 3 Effects of crude oil addition and rhizome severance ofPhragmitesaustralison soil total carbon (TC), total nitrogen (TN) and total phosphorus (TP) and their ratios as well as soil organic carbon (SOC)

處理TreatmentdfSOCTCTNTPC/NC/PN/P石油水平 Oil(O)2,3049.2???1.2ns4.3? 2.0ns0.1ns0.7ns1.8ns切斷情況 Severance (S) 1,300.7ns1.6ns2.1ns2.3ns1.4ns0.1ns5.3?O × S2,300.9ns0.9ns0.5ns0.2ns0.6ns2.7ns0.6ns

nsP≥0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

圖4 不同石油添加和根狀莖切斷處理下的土壤碳、總氮和總磷含量及其比率Fig.4 Soil carbon, total nitrogen and total phosphorus and their ratios under different crude oil addition and rhizome severance treatments柱體和豎直線分別代表均值和標準差

土壤有機質是土壤中各種含碳有機化合物的總稱,是污染土壤生物修復的基礎,其含量和組成對生物修復的可行性和修復效率均發(fā)揮著決定性的作用[47]。石油主要是碳(83%—87%)和氫(11%—14%)兩種元素組成的復雜有機混合物,包含了烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴三大類有機化合物,還包含少量重金屬元素等。與對照組相比,石油污染的蘆葦濕地土壤有機碳含量發(fā)生了較大的改變,表現(xiàn)為隨石油添加量的增加而增大。這主要是由于石油復雜的含碳有機物難于降解,并在土壤中長期停留所造成的[48]。此外,部分研究發(fā)現(xiàn),土壤有機碳含量的增高將會增大土壤的C/N和C/P,導致氮、磷等營養(yǎng)元素比例的失衡,不利于土壤微生物對石油烴的利用[49]。一般認為,土壤中生物可利用的C/P為120∶1左右,這種比例有利于改善土壤微生物對石油烴的降解[50]。然而,本研究結果表明,研究地土壤內的C/P基本不會隨著石油添加而發(fā)生顯著改變,而且土壤中的C/P值也并未維持在上述的最佳比例狀態(tài)。比如,在三種水平的石油添加下,蘆葦濕地土壤的C/P(26∶1—34∶1)均未達到微生物所需的營養(yǎng)物質比例水平。導致這一結果的可能原因是土壤中碳含量大幅度增加,而土壤磷含量沒有顯著變化,進而導致的C/P嚴重失調。本研究結果表明,石油添加對土壤總氮有顯著效應,蘆葦根圍土壤總氮含量隨石油添加量的增加而增大。我國現(xiàn)有油田中以低硫和高氮原油為主[25],添加石油后土壤總氮的增加可能與原油中的礦物元素的輸入有關[51- 52]。

克隆整合使得克隆植物的不同相連分株之間可以傳遞光合產物、礦質養(yǎng)分和水分等物質[53],從而改善處在不利環(huán)境下的分株的適合度[54- 56]。同時,克隆整合可以通過傳輸光合產物等改變分株周圍土壤理化性質[57]。例如,薛閣等[57]發(fā)現(xiàn),克隆整合顯著促進了遮蔭分株根際土壤溶解性有機碳含量和微生物生物量碳、氮含量。本研究結果也表明,克隆整合顯著影響了土壤pH值和電導率。實驗區(qū)內蘆葦根狀莖連接比切斷條件下?lián)碛懈叩耐寥离妼?可能是因為根狀莖切斷不利于分株的生長,導致分株對土壤水分的吸收較少,促使根狀莖切斷處理的分株所在的土壤水分含量比連接處理的高,從而導致較低的土壤電導率。此外,本研究發(fā)現(xiàn),克隆整合對土壤總氮和有機碳無顯著效應。盡管Lei等[19]發(fā)現(xiàn)克隆整合對土壤總氮也沒有顯著效應,但卻發(fā)現(xiàn)克隆整合可以顯著增加土壤有機碳含量和C/N。造成這種差別的原因可能有三個。第一,由于本研究選取的土樣是來自樣方內3個深度為0—20 cm的混合土壤,而非根際土壤,從而削弱了克隆整合效應[20]；第二,原油在土壤中的遷移在水平方向上受毛細管力的作用,而在垂直方向上受重力的作用[58-60]。由于插入土壤下PVC圓管的差異(5 cm與30 cm),根狀莖連接和切斷處理的樣方內的石油有可能通過毛細管力向周圍區(qū)域產生不同程度的水平擴散,從而影響了克隆整合作用。第三,不同脅迫處理和實驗環(huán)境可能導致克隆整合對土壤理化性質的影響差異。

綜上所述,石油污染和克隆整合均可以影響蘆葦濕地的土壤理化性質。此外,石油污染和克隆整合還能影響土壤微生物群落的生物量、結構和組成等[19,23,57]。例如,袁慶葉等[20]發(fā)現(xiàn)石油污染顯著影響了土壤微生物的磷脂脂肪酸總量,而Lei等[19]發(fā)現(xiàn)克隆整合顯著影響根際土壤細菌和真菌等的磷脂脂肪酸含量。因此,后續(xù)的研究將進一步利用16S rRNA高通量測序方法探討石油污染和克隆整合對蘆葦濕地土壤微生物群落的影響以及微生物群落與土壤理化性質的關系,以期了解克隆整合與土壤微生物群落的關系,并為微生物生態(tài)學的研究和黃河三角洲濕地石油污染土壤的生物修復技術提供新思路。黃河三角洲濱海濕地受海陸交互作用的影響,其土壤鹽度較高,且位于不同海拔(高程)區(qū)域的土壤鹽漬化程度也不同,鹽分對其生態(tài)過程具有十分重要的影響[61- 63]。在本實驗中,我們沒有設計不同的土壤鹽分水平和異質性,因此無法探討土壤鹽分對克隆整合的影響。因此,后續(xù)的研究可進一步考慮鹽分水平和鹽分異質性與克隆整合的交互作用對濕地土壤理化性質和微生物結構和組成的影響。

致謝：感謝北京林業(yè)大學自然保護區(qū)學院劉超明同學在土壤理化性質測定實驗中給予的幫助。