方澤民，劉娟娟，房 偉，肖亞中

（安徽大學生命科學學院，安徽合肥230601）

1972年，Paul等人在分子生物學和分子遺傳學等學科綜合發(fā)展的基礎上，創(chuàng)立了基因工程學[1]?；蚬こ痰恼Q生和應用，使得生命科學發(fā)生了革命性的變化。近年來，隨著科學技術(shù)的快速發(fā)展，基因工程技術(shù)取得了重要進展，基因工程的內(nèi)涵也逐漸拓展，從最初的“將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體細胞內(nèi)，使之穩(wěn)定遺傳，表達出新產(chǎn)物或新性狀”，拓展到現(xiàn)如今的包含基因設計與構(gòu)建等上游技術(shù)，以及基因工程菌（細胞）的規(guī)模制備、表達產(chǎn)物的分離純化等下游技術(shù)的DNA 重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設計與應用。目前，基因工程已成為現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的核心內(nèi)容。相應的，“基因工程原理”也已成為生命科學相關(guān)專業(yè)的一門重要專業(yè)基礎課程[2]。作為一門理論性和實踐性均很強的專業(yè)課程，“基因工程原理”具有專業(yè)性強、內(nèi)容抽象、知識點多等特點[3]，單純的依托教材“以教為主”、“照本宣科”的傳統(tǒng)注入式教學已不能滿足啟發(fā)和引導學生學習課程的積極性和主動性[2,4]。同時，由于基因工程的前沿性特征，其技術(shù)發(fā)展更新迅速，而現(xiàn)有教材更新速度慢，單純依賴教材已不能滿足學生對前沿知識的渴求。因此，改革“基因工程原理”傳統(tǒng)教學方法，已成為提高教學質(zhì)量、培養(yǎng)現(xiàn)代生物技術(shù)人才的重要保證[5]。多元互動式教學，通過多種互動教學方式，包括教師講授、專題研討以及翻轉(zhuǎn)課堂等形式，活躍課堂氣氛，在老師和同學的互動中，將基礎知識和最新進展以輕松的方式傳遞給學生，更好地喚起學生主動學習的積極性，系統(tǒng)掌握基因工程技術(shù)的理論、方法和技術(shù)，并培養(yǎng)學生發(fā)現(xiàn)問題、思考問題、解決問題的能力。這種互動教學方式，還可以增進老師與學生之間的交流和討論，促進教學相長。近年來，安徽大學生命科學學院“基因工程原理”課程組積極開展教學改革，開展了該課程的多元互動教學模式的嘗試和探索。本論文以“基因工程原理”課程中“PCR技術(shù)及其應用”為例，對多元互動式教學模式的實施方法和過程進行總結(jié)和討論。

1 多元互動式教學模式的主要實施過程

聚合酶鏈式反應技術(shù)，即PCR 技術(shù)，是美國Cetus 公司人類遺傳研究室的Mullis K.R.于1983 年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或者DNA 序列的方法[6]。PCR 技術(shù)使分子生物學方法發(fā)生了驚人的轉(zhuǎn)變，自納入冷泉港第51次定量生物學研討會以來，逐漸成為分子生物學實驗室不可或缺的組成部分[6-7]。如今，任何研究人員不再需要對研究方案仔細推敲，只要有齊全的試劑和一臺PCR循環(huán)儀，就可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)DNA 數(shù)量的指數(shù)級擴增。PCR 技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的基本技術(shù)，其教學內(nèi)容主要包含PCR技術(shù)原理、PCR體系的主要成分及功能、PCR技術(shù)的應用等部分，教學的效果是讓學生在掌握原理基礎上解決實際問題，最終實現(xiàn)技術(shù)的靈活應用。因此，課程組根據(jù)本章節(jié)的教學內(nèi)容，將課堂教學分解成理論教學、知識問答、技術(shù)應用專題研討等形式開展。

1.1 PCR技術(shù)理論教學

PCR 技術(shù)快速敏感、簡單易行，原理并不復雜：首先是雙鏈DNA 分子在臨近沸點的溫度下加熱變性，彼此分離成兩條單鏈DNA分子；然后，反應體系降至低溫（50～60°C），體系中專門設計的一對短引物分別與兩條單鏈堿基互補配對；最后調(diào)溫度至DNA 聚合酶最適反應溫度（72°C），DNA 聚合酶以單鏈DNA 為模板，在引物鏈的引導下合成新的互補鏈。上述步驟經(jīng)過20～30 次循環(huán)，就可以獲得足夠的DNA 分子用于后續(xù)研究。此環(huán)節(jié)的教學只需要學生掌握總體框架，即“高溫變性，低溫退火，適溫延伸”[1]。下面將通過對PCR體系中組分的詳細介紹，讓學生理解該原理[1,8]。

（1）模板DNA，即含有目標序列的模板DNA 樣本。在PCR 過程中，需要將反應體系溫度升溫至90oC以上，即“高溫變性”，目的是獲得單鏈DNA模板用于后續(xù)擴增。教學過程中，需要強調(diào)另一點，即理論上反應體系中僅有單拷貝DNA序列即可滿足PCR反應的擴增。然而，在實際操作中，為了獲得比較滿意的擴增效果，模板DNA的分子數(shù)一般選擇105～106左右。

（2）引物，即與待擴增的目標DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的2段寡核苷酸短片段，長度一般為15～30個核苷酸之間。由于PCR反應依賴于DNA聚合酶，而DNA聚合酶的特征是需要有一段寡核苷酸鏈進行引導才能啟動鏈的延伸，因此反應體系中需要添加引物?！暗蜏赝嘶稹钡哪康氖菫榱俗屢锱c模板DNA配對。引物的選擇取決于擴增的目標序列，兩段引物之間的距離決定了擴增區(qū)段的長度。寡核苷酸引物的設計，對于所需片段的高產(chǎn)量擴增、以及抑制不必要的、非特異性的序列擴增都是非常關(guān)鍵的。引物的設計目前主要依賴于軟件例如Primer 5，選擇也更多的是依賴于常識。一般情況下，引物的長度、內(nèi)部重復和互補序列以及引物間的互補、溶解溫度、GC 發(fā)夾等均能夠影響引物的質(zhì)量。寡核苷酸引物退火溫度可通過簡易公式計算。

（3）熱穩(wěn)定DNA 聚合酶。目前，依賴模板催化的熱穩(wěn)定DNA 聚合酶有很多種類可供選擇，例如Taq DNA聚合酶，其來自于棲熱水生菌（Thermus aquaticus），是常規(guī)PCR反應的首選酶。除此之外，還有其他類型的DNA 聚合酶，如HiFiTaq、LA-Taq、熱啟動DNA 聚合酶等。教學過程中，以時間為線索，通過簡單回顧DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展歷史，讓學生了解不同DNA聚合酶之間的區(qū)別（優(yōu)、缺點）及應用領(lǐng)域。由于DNA聚合酶也是一種蛋白質(zhì)，其活力受溫度的影響，發(fā)揮最佳活性的溫度在72°C左右，因此，需要將體系溫度升溫至酶蛋白的最適溫度，即“適溫延伸”。

（4）陽離子。所有熱穩(wěn)定的DNA聚合酶都需要游離的二價陽離子，通常使用Mg2+用于激活酶蛋白活力。然而，反應體系中由于脫氧核糖三磷酸（dNTP）會結(jié)合Mg2+，二價陽離子的濃度必須超過dNTP的濃度。此外，體系中一般還包括一價金屬離子，通常為K+，用于提高擴增序列的效率。

（5）PCR 反應體系中包括4 種濃度為200 μmol/L 左右的dNTP。授課時，需要強調(diào)，過高濃度的dNTP會抑制反應的進行，因為其可以結(jié)合Mg2+，降低其濃度并最終影響DNA聚合酶活力。

（6）維持pH的緩沖液。PCR反應的pH一般維持在8.5左右。

1.2 理論知識問答

基因工程原理教學的直接效果是讓學生在掌握原理的基礎上解決實驗中的具體問題。因此，在理論講授完成后，針對PCR 技術(shù)操作過程中的細節(jié)及可能出現(xiàn)的問題，課程組會收集相關(guān)“問題PCR”電泳結(jié)果，通過展示不同條件下的DNA 電泳圖譜，讓學生進行分析。例如，PCR 反應擴增的目標條帶較弱或者不能檢測到相應的條帶，擴增產(chǎn)物條帶不單一，引物二聚體過量等。針對這些問題，授課教師與學生一起進行開放式討論，分析原因，給出相應的解決方案，幫助學生梳理具體問題及對策，并最終以表的形式進行統(tǒng)計分析和總結(jié)[8]，方便學生在后期實際操作中理性分析問題并解決問題。

1.3 技術(shù)應用專題研討

基因工程原理教學的最終教學效果是讓學生在掌握技術(shù)原理基礎上實現(xiàn)技術(shù)的靈活應用。對于PCR 技術(shù)而言，其包含普通PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、反向PCR 等，它們在基于PCR 的分子診斷等方面的應用日益廣泛[1,7-8]。為幫助學生更好地了解PCR技術(shù)的應用，在本次課程教學的前一周，授課教師提前布置研討任務。要求學生以小組為單位（一般3～4 人一組），主動挖掘信息并準備關(guān)于PCR在某一領(lǐng)域應用的相關(guān)知識，制作成3～5分鐘時間的PPT材料。課堂教學時，教師隨機抽取學生進行講演。小組成員在確定主題后需要在微信群內(nèi)發(fā)布，有效避免不同小組之間話題的重復。在同學演講過程中，老師適時參與話題的討論與延伸。

2 多元互動式教學模式的靈活運用

基因工程不同技術(shù)具有不同的特點，同時它們之間又可以相互融合，組合成一個有機的整體[4-5]。因此，針對不同的教學章節(jié)，采用不同的互動式教學模式就變得尤為重要。現(xiàn)代化的多媒體教學手段具有圖、文、聲并茂的特點，可以“化靜為動”、多方位展示知識點[9]。因此，在進行抽象知識如RNA干擾原理的講授時，引入動態(tài)原理視頻進行展示，效果遠優(yōu)于枯燥的PPT圖片和文字展示，克服難以將抽象內(nèi)容講解透徹的弊端[10]。不同的技術(shù)之間可以進行有效銜接，而自主設計實驗可以幫助學生進行不同技術(shù)的有效銜接[4]。例如在講授基因工程的基本技術(shù)時，通過命題的方式，如“提供一條酶蛋白DNA編碼序列和表達載體序列，讓學生完成序列表達載體的構(gòu)建”，幫助學生將學習過的知識如限制性內(nèi)切酶、電泳、載體克隆、PCR 擴增等進行整合，完成實驗設計。這種方式可以讓學生更好地發(fā)揮主觀能動性，系統(tǒng)復習前期學習的內(nèi)容，并通過仔細思考，設計實驗，掌握課程知識點[11-12]?；蚬こ碳夹g(shù)發(fā)展快速，不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)和應用。在教學過程中，我們也會針對某種技術(shù)的最新進展，給學生指派最新的研究論文，讓學生閱讀后在課堂進行文獻講解，授課教師進行文獻閱讀的點評和補充，幫助學生了解最新的研究進展。

3 多元互動式教學模式目前遇到的問題

在幾年的實踐過程中，我們也發(fā)現(xiàn)了一些問題。例如，在主題討論中，我們是以小組形式開展，小組成員過多，在準備相關(guān)資料時存在分工不均勻、部分學生偷懶不作為，以及分組過多導致研討環(huán)節(jié)占用大量時間，影響教學進度等。因此，建議以小班教學模式開展教學（每個班級15～20個學生），學生每次分為5組左右，可有效避免分組過多導致的學時不足。在教學過程中，發(fā)現(xiàn)個別小組在準備相關(guān)素材和制作PPT 時，存在直接復制、粘貼相關(guān)內(nèi)容，更有甚者，直接不經(jīng)修改地利用網(wǎng)絡資源等現(xiàn)象。這種現(xiàn)象導致學生不能更好地進行深入理解和思考，同時會導致部分信息滯后。為避免這些現(xiàn)象的發(fā)生，充分利用課程教學微信群，要求學生將準備的素材上傳至群內(nèi)共享；同時，在課堂演講環(huán)節(jié)，要求學生在PPT 中列出參考文獻，并加強提問和討論。另外，在實踐中也發(fā)現(xiàn)，部分同學渴望通過自己的努力，參與到課程知識點的討論中。然而，他們中的部分同學在專業(yè)文獻資料的檢索、閱讀和整理方面存在困難，另一部分同學在進行科學表述方面較為薄弱。盡管在教學過程中，課程組老師就相關(guān)的文獻檢索、整理和講演方面的知識做過介紹，但畢竟時間有限，只能涉及非常窄的知識面。因此，課程組也建議配套相關(guān)的專業(yè)選修課，例如“文獻檢索與科技論文寫作”、“科學寫作與交流”等課程，幫助學生全面發(fā)展。

4 結(jié)束語

經(jīng)過幾年的摸索與經(jīng)驗總結(jié)，“基因工程原理”課程教學的學生參與度逐年提高，相應的，學生成績也在不斷提高；尤為明顯的是學生運用知識的能力有了較大提升。通過專項問卷調(diào)查及與學生的日常溝通和討論，學生普遍反映通過多元互動教學，學生的學習積極性、主動性和參與度均不同程度提高。例如，學生反饋，通過課前的預習，對新知識有了一些感性的認識，也初步掌握了自己在哪些知識點存在疑惑或者薄弱環(huán)節(jié)。因此，在課堂教學過程中，他們會更專注，效率更高。教學是科研的基礎，科研是教學的提高和發(fā)展。多元互動式教學模式在“基因工程原理”課程中的應用，在提高學生學習主動性的同時，對教師也提出了更高的要求。總之，“基因工程原理”的教學改革是一個系統(tǒng)工程，在探索中不斷適應新的形勢，引入新的素材和內(nèi)容，不斷提高教學水平和教學效果。