劉進蘭 楊雪 李雙雙 張玉明 柳峰松 唐婷 李紅權

（河北大學，保定 071000）

生物體受到外界脅迫時，會激活防御機制抵御外界侵害，例如誘導抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）的表達殺死入侵細菌是重要的免疫防御之一。抗菌肽是一類低分子量的短肽，大多數(shù)是由陽離子和疏水性殘基組成的兩親性分子［1-3］。由于抗菌肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、絲狀真菌和原生生物以及包膜病毒在內(nèi)的微生物都具有快速且有效的殺傷效果，因此被稱為“自然抗生素”［4-5］。抗菌肽與抗生素對細菌作用的機制不同，抗生素多是通過抑制細菌細胞壁的合成來抑制細菌的生長，濫用抗生素會產(chǎn)生高度耐受抗生素的細菌以及超級細菌，導致藥效下降［6］。而大多數(shù)抗菌肽都是通過靜電作用和疏水作用吸附于細菌細胞膜，破壞膜結構使內(nèi)溶物外漏，發(fā)揮殺菌活性，這種獨特的作用機制使細菌很難通過改變細胞膜成分對抗菌肽產(chǎn)生耐藥性［7］，因此抗菌肽成為了抗生素理想的替代品。

家蠅（Musca domestica）是雙翅目蠅科昆蟲，在我國分布廣泛，與人類生活密切相關。它們攜帶成百上千種病菌，能夠傳播多種疾病，嚴重危害人類健康，被認為是一種世界性的衛(wèi)生害蟲。家蠅通常生活在腐敗、骯臟的惡劣環(huán)境下，但種群卻十分強大，咎其原因是由于家蠅具有強大的先天免疫系統(tǒng)，可以有效的抵御外源侵擾［8-9］。昆蟲具有識別細菌、真菌、寄生蟲和病毒等病原體的有效機制，通過信號轉導途徑引發(fā)細胞免疫和體液免疫反應［10-11］，其中抗菌肽是昆蟲體液免疫中關鍵的抗菌因子，在先天免疫中占據(jù)十分重要的地位。已鑒定的家蠅抗 菌 肽 有 attacin［12］、cecropin［13］、diptericin［14］、defensin［15］、MDAP-2D［16］及 Muscin［17］等。 本 實驗室通過生物信息學篩選出一個潛在的抗菌肽基因，將其命名為domesticin［18］，該基因氨基酸序列具備抗菌肽分子量小、富含脯氨酸、疏水性氨基酸較多等特征，本文利用畢赤酵母（Pichia pastoris）真核表達系統(tǒng)對其進行體外表達，并驗證其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠅種蠅由中國科學院動物研究所何鳳琴老師于2007年惠贈，一直在本實驗室繁殖至今。由本實驗室保種和飼養(yǎng)，幼蟲飼料配方為90 g麩皮、5 g白糖、5 g奶粉及適量無菌水。飼養(yǎng)溫度25℃，相對濕度50%-70%。

大腸桿菌感受態(tài)Trans-T-1購自北京全式金生物技術有限公司，表達載體pPIC9K由實驗室保存，畢赤酵母KM71菌株由河北大學生命科學院李繼剛教授實驗室惠贈。遺傳霉素G418購自北京博奧拓達科技有限公司，抗His標簽兔多克隆抗體購自康為世紀生物科技有限公司，山羊抗兔抗體購自生工生物工程有限公司。His蛋白純化試劑盒Ni Resin FF購自金斯瑞生物科技有限公司。抑菌實驗所用菌種由中科院動物研究所朱順義研究員和河北大學生命科學學院孫磊教授饋贈。革蘭氏陽性菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）；革蘭氏陰性菌：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、傷寒桿菌（Salmonella typhi）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維式氣單胞菌（Aeromonas veronii）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形菌（Proteus species）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痢疾菌屬（Shigella sp.）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、河生腸桿菌（Enterobacter amnigenus）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和反轉錄 以Total RNA提取試劑RNAiso Plus提取3齡家蠅幼蟲的總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用核酸定量儀測定其濃度和純度，取1 μg總RNA，以AOLP為引物：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACT16（G/A/C）-3'反轉錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆、重組表達載體的構建及電轉化 根據(jù)家蠅轉錄組序列信息，設計domesticin基因特異引物 domesticin-F：5'-GTATCGGCATCTCGTGACTC-3'，以家蠅幼蟲cDNA為模板，利用domesticin-F和AP：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'進行 3'RACE擴增。根據(jù)家蠅domesticin基因編碼成熟肽序列設計引物，在引物5'端分別引入酶切位點EcoRI和NotI，并在酶切位點EcoRI后加入6×His標簽。上游引物P1：5'-CGGAATTCCATCATCATCATCATCAT TCTCGTGACTCCAGACCTGTTC-3'（下劃線處EcoRI酶切位點），下游引物P2：5'-AAGGAAAAAAGCGG CCGCTTAAGCGTACATAGTTTTTCGTC-3'（下劃線處為NotI酶切位點）。以家蠅的cDNA為模板，以引物P1和P2進行目的片段的PCR擴增，回收目的片段后用EcoRI和NotI進行雙酶切。將雙酶切后的目的片段連接至經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后的pPIC9K載體，將其轉化大腸桿菌感受態(tài)Trans-T-1中，篩選陽性克隆并測序驗證表達載體pPIC9K-domesticin讀碼框是否正確。之后將表達載體pPIC9K-domesticin用SacI線性化后電轉化入畢赤酵母KM71感受態(tài)中，平行設置pPIC9K載體為對照。電轉化后將轉化子涂布在MD平板上（所含物質的質量濃度分別為無氨基酸酵母氮源基礎培養(yǎng)基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L），將平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單個菌落。

1.2.3 遺傳霉素篩選及PCR鑒定轉化子 利用無菌水重懸酵母重組子，將酵母重組子分別涂布于含有不同遺傳霉素濃度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD平板上（所含物質的質量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L），于30℃培養(yǎng)。待不同遺傳霉素條件下長出單克隆菌落后，在對應的遺傳霉素條件下進行劃線培養(yǎng)。挑取菌落為模板，以P1和P2，pPIC9K載體上的5'AOX1（5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和P2為引物，分別進行PCR擴增鑒定各轉化子插入情況。

1.2.4 重組pPIC9K-Domesticin的誘導表達、蛋白檢測及分離純化 將陽性重組子置于BMGY培養(yǎng)基中（所含物質的質量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L），在30℃200 r/min條件下培養(yǎng)，當OD600=2-6時收集菌體并重懸于BMMY培養(yǎng)基中（所含物質的質量濃度分別為酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L），于30℃下200 r/min培養(yǎng)，每間隔24 h添加無水甲醇，使其終濃度為0.5%。誘導96 h后收集發(fā)酵上清液進行Tricine-SDS-PAGE分析，并以抗His標簽兔多克隆抗體為一抗，以山羊抗兔抗體為二抗對表達產(chǎn)物進行Western Blot檢測。按照His標簽蛋白純化試劑說明書對帶有6×His標簽的融合蛋白Domesticin進行純化，并用牛血清蛋白BSA作為對照，Bradford法測定蛋白的濃度。

1.2.5 Domesticin的抑菌活性檢測 將抑菌實驗菌株在37℃ 200 r/min LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按照1%接種量轉接培養(yǎng)至OD600=0.2左右。用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋菌液100倍備用。將純化后的Domesticin蛋白用無菌水進行稀釋，取90 μL細菌稀釋液和10 μL蛋白稀釋液加入96孔板中，23℃ 100 r/min 培養(yǎng)12 h。分別以10 μL無菌水和10 μL氨芐青霉素（30 μg/mL）作為陰性和陽性平行對照。在OD600下檢測實驗組和對照組菌液的濁度，來判斷其是否具有抑菌活性，并測定最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），MIC定義為與陰性對照組相比實驗組達到85%以上細菌死亡的多肽濃度。不同濃度的樣品進行3次實驗重復。

2 結果

2.1 目的基因的擴增及表達載體pPIC9K-domesticin的構建

PCR克隆獲得家蠅domesticin基因全長cDNA序列364 bp，此序列包含198 bp完整的開放閱讀框，5'末端非翻譯區(qū)114 bp，3'末端非翻譯區(qū)52 bp。該基因推導的氨基酸序列含有65個氨基酸，其中含有25個氨基酸的信號肽（圖1），其成熟肽理論分子量為4.58 kD。以家蠅cDNA為模板，P1和P2為引物對domesticin基因編碼成熟肽序列進行PCR擴增，電泳結果（圖2）顯示100-250 bp位置有特異性片段。對構建的pPIC9K-domesticin表達載體進行雙酶切驗證，雙酶切后出現(xiàn)兩條特異條帶，其中小片段與domesticin大小一致，另一條帶為pPIC9K線性質粒（圖3）。

2.2 高拷貝轉化子的篩選以及PCR鑒定

經(jīng)遺傳霉素G418不同濃度梯度篩選，濃度低于3 mg/mL的遺傳霉素YPD平板上長出了數(shù)目不等的轉化子，而4 mg/mL的遺傳霉素YPD平板上未見轉化子長出，在3 mg/mL遺傳霉素的YPD平板上長出11個畢赤酵母轉化子。引物P1和P2檢測片段預期大小為123 bp，載體引物5'AOX1和引物P2檢測片段預期大小為514 bp，同時以空質粒pPIC9K作為陰性對照，結果顯示兩種配對引物擴增的片段大小均與預期值相符，且11個轉化子均為陽性克?。▓D 4）。

圖1 家蠅domesticin基因cDNA及其推導的氨基酸序列

M：DNA Marker；1：家蠅domesticin基因PCR產(chǎn)物

圖3 重組表達載體pPIC9K-domesticin雙酶切驗證

2.3 重組酵母表達產(chǎn)物的檢測

任取一株篩選到的酵母pPIC9K-domesticin高抗性轉化子進行誘導培養(yǎng)，質粒pPIC9k轉化子為陰性對照，分別收集誘導培養(yǎng)96 h的發(fā)酵上清，三氯乙酸濃縮后經(jīng)Tricine-SDS-PAGE及Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)在大約5.4 kD位置出現(xiàn)了與融合蛋白預期大小相符的條帶，而pPIC9k質粒對照未出現(xiàn)條帶（圖5）。鎳柱純化后得到Domesticin的蛋白濃度為78.22 μg/mL。

1-11：P1，P2為引物鑒定的陽性克??；a-k：載體引物5' AOX1和P2為引物鑒定的陽性克??；空：質粒pPIC9K陰性對照；M：DNA Marker

圖5 畢赤酵母表達Domesticin重組蛋白的Tricine-SDSPAGE分析（A）及Western Blot鑒定（B）

2.4 抑菌活性檢測

家蠅抗菌肽Domesticin對各種細菌的最小抑菌濃度（MIC）見表1，實驗表明Domesticin對巨大芽孢桿菌在內(nèi)的22種受試細菌都具有抑菌作用，其中對革蘭氏陽性菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）抑制作用最強，其MIC值為0.55 μmol/L，對革蘭氏陰性菌棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）的抑制作用最弱，其MIC值為12.68 μmol/L。從結果可以看出家蠅抗菌肽Domesticin對革蘭氏陽性菌的抑制效果要強于革蘭氏陰性菌。

表1 家蠅抗菌肽Domesticin對于細菌的最小抑菌濃度（MIC）

3 討論

抗菌肽可以直接從生物體中提取分離，但是由于生物體中天然抗菌肽含量較低，提取工藝復雜且難以得到較為單一的抗菌肽成分，從而在一定程度上限制了抗菌肽的研究［19-20］。雖然可以利用化學合成獲得抗菌肽，但化學合成的抗菌肽與天然抗菌肽結構存在差異，往往需要對其結構進行修飾后才具有活性。如楊雪等［17］通過化學合成的線性抗菌肽1-Muscin無抑菌活性，而環(huán)化修飾后的c-Muscin對多種細菌都有抑制作用；Hao等［21］在BuforinⅡ衍生肽BF2-A的結構特征基礎上設計合成了新肽BF2-X，BF2-X對細菌的抗菌活性強于BF2-A，且BF2-X殺菌速度比BF2-A快速；Xie等［22］通過化學合成了非洲爪蛙的抗菌肽CPF-C1，雖然CPF-C1對耐藥性細菌有較好的抑菌活性，但是CPF-C1穩(wěn)定性差，而對其結構改造后的類似物CPF-8穩(wěn)定性好且抗菌活性持久。此外有研究者利用原核系統(tǒng)表達抗菌肽，凌霄利用原核表達系統(tǒng)對太平洋牡蠣的抗菌肽cgMolluscidin進行融合表達，但該系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后修飾功能，使得該抗菌肽沒有抑菌活性［23］。有時，由于抗菌肽強烈的抑菌活性，會在其表達過程中將宿主殺死，使得重組表達難以在原核微生物中進行。畢赤酵母能夠表達各種重組異源蛋白，被認為是一種理想的真核表達宿主［24］。與其他真核及原核表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有易于操作，多種轉錄后修飾（如多肽折疊，?；腔?，甲基化等），遺傳系統(tǒng)穩(wěn)定及蛋白可高水平表達等優(yōu)點［25］。Xu 等［26］將鱟（Limulus polyphemus）中的基因tachyplesinII轉入畢赤酵母并成功表達具有抑菌活性的抗菌肽。Luiz等［27］利用酵母系統(tǒng)重組表達了蜜蜂的抗菌肽，該抗菌肽對大腸桿菌具有抑菌作用。

畢赤酵母菌株主要有KM71、GS115、SMD1168及X33等。蔡晶晶等［28］利用畢赤酵母GS115表達了來自黑鯛的抗菌肽hepcidin，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌和溶壁微球菌具有抑菌活性。Chen等［29］利用畢赤酵母SMD1168表達了來自蜜蜂的抗菌肽IC-20，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌具有抑制效果。Li等［30］利用畢赤酵母X33表達了來源于雞的抗菌肽Fowlicidin-2，該抗菌肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及粘質持沙雷氏菌具有明顯的抑菌效果。在GS115、SMD1168及X33這些酵母菌株中，目的基因在轉化及整合的過程中會產(chǎn)生Mut+及Muts兩種不同表型，需要用甲醇最小培養(yǎng)基（MM）來篩選其屬于何種表型，這使得操作變得復雜。

本研究利用畢赤酵母菌KM71作為表達宿主，其優(yōu)勢在于不需要用MM培養(yǎng)基來篩選Mut表型，因為其所有轉化子都是Muts表型。這就為篩選轉化子節(jié)省了精力及成本。常用的畢赤酵母表達載體主要有pPICZα-A和pPIC9K兩種，前者屬于胞內(nèi)表達載體，后者屬于分泌到胞外的載體。此外，載體不同篩選高拷貝轉化子時所用的抗生素不同。pPICZα-A用博來霉素來篩選高拷貝轉化子，而pPIC9K則用遺傳霉素來進行篩選?？股貪舛仍礁邉t插入到酵母基因組中的目的片段的拷貝數(shù)越多，一般認為0.25 mg/mL遺傳霉素篩選含1-2個拷貝數(shù)，4 mg/mL含7-12個拷貝數(shù)，通過篩選出高抗生素濃度的轉化子來提高蛋白表達量。本研究篩選出了遺傳霉素濃度最高為3 mg/mL的轉化子，對其進行誘導表達后發(fā)現(xiàn)其蛋白表達量高于遺傳霉素濃度為0.25 mg/mL的轉化子的蛋白表達量。

本實驗室化學合成的Domesticin多肽對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）、脲芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae）、變形菌（Proteus species）、穩(wěn)定伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）、雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、河生腸桿菌（Enterobacter amnigenus）、棲冷克呂沃爾菌（Kluyvera cryocrescens）的最低抑菌濃度均大于100 μmol/L［18］，可認為對這些菌基本無抑菌作用。而本研究利用畢赤酵母表達的Domesticin對上述細菌都具有很強的抑制效果，這表明與合成Domesticin多肽相比，畢赤酵母表達的Domesticin抑菌譜更廣。這可能是由于畢赤酵母真核表達系統(tǒng)所表達出的抗菌肽更加接近其天然構型，并呈現(xiàn)了其原有活性。此外，該抗菌肽對人類致病菌傷寒桿菌（Salmonella typhi）、痢疾菌屬（Shigellasp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和人畜共患致病菌雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）均有抑制作用，這說明該抗菌肽具有成為新型抗生素的潛力，為解決細菌耐藥性問題提供新的思路和方向。同時，Domesticin對水產(chǎn)動物重要致病菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）及維式氣單胞菌（Aeromonas veronii）也有抑制作用，這可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病菌感染提供新的治療方案。

4 結論

本研究構建了家蠅新型抗菌肽Domesticin成熟肽在畢赤酵母KM71的表達載體，甲醇誘導表達后進行蛋白檢測，Tricine-SDS-PAGE及Western Blot分析結果表明，Domesticin在畢赤酵母中成功表達，抑菌實驗顯示Domesticin對受試革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，是一種新型廣譜抗菌肽。