王俊燚 董金金 劉偉 曹福亮 汪貴斌 王義強

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室，長沙 410004；2. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037；3. 中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）又名白果，最早出現(xiàn)于古生代石炭紀(jì)，迄今已有3.45億年，現(xiàn)僅存一科一屬一種，是我國珍貴的孑遺植物［1-3］。不僅具有極高的觀賞價值，還具有極高的經(jīng)濟價值和科學(xué)研究價值［4］。其中，銀杏中的黃酮類化合物具有抗氧化、抑菌、治療心血管疾病及保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用，是國內(nèi)外植物藥用成分的開發(fā)熱點［5-6］。盡管銀杏黃酮的傳統(tǒng)提取方法已十分成熟，但由于占有大量耕地，也無法避免環(huán)境影響，仍存在許多不足［7］。運用植物組織培養(yǎng)的方法生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能排除不良環(huán)境影響，解決自然資源短缺與森林破壞問題，是目前國內(nèi)外研究的重要方向［8-9］。

然而，銀杏愈傷組織在實際培養(yǎng)中存在生長緩慢、易褐化和次生代謝物產(chǎn)量低等問題，無法達到工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)。近年來，為了探究適宜銀杏愈傷組織生長與黃酮積累的條件，國內(nèi)外學(xué)者研究了取材部位、基本培養(yǎng)基和激素種類等方面的影響［9-11］，但鮮有綜合討論細胞生長、褐化與黃酮積累的研究，更未見利用正交實驗探究總黃酮實際產(chǎn)量的報道，缺乏工業(yè)生產(chǎn)指導(dǎo)性。同時程水源等［12］研究表明，銀杏葉黃酮含量在不同月份間存在較大差異，且外植體中酚醌類底物隨著月份的積累也可能會影響愈傷組織的生長與褐化［13］，而目前尚未在銀杏愈傷組織培養(yǎng)中見到關(guān)于外植體月份對細胞生長與黃酮積累影響的研究；綜合研究外植體、激素和抗褐化劑共同影響下的銀杏愈傷組織生長與黃酮積累，具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以銀杏4、5、6月份葉片誘導(dǎo)的愈傷組織為供試材料，選用萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA）為細胞生長素、呋喃氨基嘌呤（Kinetin，KT）為細胞分裂素，抗壞血酸（Ascorbic acid，VC）為抗褐化劑，在繼代中設(shè)計正交實驗考察四因素交互作用下銀杏葉愈傷組織的生長指數(shù)、褐化指數(shù)及黃酮含量差異。結(jié)合供試銀杏樹4、5、6月葉片黃酮含量與愈傷組織的總黃酮產(chǎn)量，旨在發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷組織生長與黃酮積累規(guī)律，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試材料為4、5、6月中旬中南林2號葉片誘導(dǎo)且在恒溫組培室中繼代三次的愈傷組織。

1.1.2 試劑 MS培養(yǎng)基自制（含3%蔗糖，0.6%瓊脂）；植物激素萘乙酸（NAA）和呋喃氨基嘌呤（KT）購自Sigma公司；抗壞血酸（VC）購自國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器 202-0A型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），高效液相色譜儀LC-2010A HT（日本島津），JY92-2D超聲波破碎儀（寧波新芝科器研究所）。

1.2 方法

1.2.1 銀杏愈傷組織正交繼代培養(yǎng) 各月份銀杏葉愈傷組織在相同條件下繼代3次后，選擇生長旺盛、色澤黃綠的愈傷組織，按正交實驗設(shè)計進行繼代培養(yǎng)。每瓶愈傷組織接種鮮重為0.3 g，培養(yǎng)基選取MS基本培養(yǎng)基，添加激素為NAA與KT組合，抗褐化劑為VC，選用 L9（34）正交設(shè)計表（表1），在40 d的繼代周期內(nèi)設(shè)計正交實驗考察銀杏葉愈傷組織的生長、褐化及黃酮積累（表2）。

表1 L9（34）正交因素水平設(shè)計表

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計表

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.2.3 生長指數(shù)測定 以每瓶銀杏愈傷組織的鮮重（Fresh weight，F(xiàn)W）為生長指標(biāo)，銀杏愈傷組織處理每8 d隨機取5瓶稱鮮重，取平均值并計算生長指數(shù)，生物學(xué)重復(fù)3次。

銀杏愈傷組織生長指數(shù)=（收獲時愈傷組織鮮重-接種時愈傷組織鮮重）/接種時愈傷組織鮮重

1.2.4 褐化指數(shù)測定 每8 d對各組銀杏愈傷組織處理總體進行觀察，按以下標(biāo)準(zhǔn)評定褐化級別并計算褐化指數(shù)［14］。

愈傷組織褐化級別評定：0級：愈傷組織呈黃綠色；1級：愈傷組織呈淡黃色；2級：愈傷組織呈淺褐色；3級：愈傷組織呈深褐色。

銀杏愈傷組織褐化指數(shù)=∑（褐化級別×該褐化級別瓶數(shù)）/（總瓶數(shù)×4）

1.2.5 總黃酮含量測定

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱supersil ODS2 5 μm；進樣量：10 μL；流動相：甲醇-0.4%磷酸（50∶50）；流速：1 mL/min；檢測波長360 nm。

1.2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱定五氧化二磷干燥過夜的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品6 mg、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品6 mg、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得槲皮素、山奈酚、異鼠李素濃度分別為120、120、80 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取該對照品溶液1.562 5、3.125、6.25、12.5和 25 mL分別置于 50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）依次進樣，重復(fù)3次，以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.4 銀杏葉片黃酮提取與含量測定 分別取4、5、6月中旬中南林二號當(dāng)年生葉片，清水沖洗后轉(zhuǎn)移至恒溫烘箱110℃殺青10 min，隨后轉(zhuǎn)入60℃烘干12 h至恒重，冷卻研細過100目篩，稱量干重（Dry weight，DW）。按中國藥典（2015）方法提取總黃酮并制備供試溶液，HPLC進樣后，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量，生物學(xué)重復(fù)3次。

總黃酮醇苷含量（mg/g）DW：（槲皮素含量+山奈酚含量+異鼠李素含量）×2.51

1.2.5.5 銀杏愈傷組織黃酮提取與含量測定 各處理組繼代培養(yǎng)至40 d時，每組隨機取10瓶生長旺盛的銀杏愈傷組織，按上述相同方法提取、測定并計算總黃酮含量，重復(fù)3次。

1.2.6 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量計算 根據(jù)40 d時各組愈傷組織的平均干重（g/瓶）與總黃酮含量，以下式計算總黃酮產(chǎn)量：

愈傷組織總黃酮產(chǎn)量（mg/瓶）=愈傷組織干重（g/瓶）×總黃酮含量（mg/g）

2 結(jié)果

2.1 銀杏愈傷組織生長指數(shù)分析

各月份銀杏葉愈傷組織相同條件下繼代3次后，按照正交實驗設(shè)計進行40 d的繼代培養(yǎng)，接種后每8 d計算各試驗號生長指數(shù)；愈傷組織繼代至40 d，均有明顯生長（圖1），統(tǒng)計愈傷組織各時期生長指數(shù)，結(jié)果見圖2。

圖1 銀杏愈傷組織生長進程

圖2 銀杏愈傷組織生長指數(shù)曲線

據(jù)圖2可知銀杏愈傷組織生長趨勢在不同時間節(jié)點間有較大區(qū)別，以0-16 d為緩慢生長期；16-32 d進入快速增長期；32 d以后生長速率又明顯降低。截止到第40 d，銀杏葉愈傷組織的正交繼代實驗中生長指數(shù)最高的為第6組，達到5.75，最低的第4組為4.20。

通過直觀分析40 d時的銀杏葉愈傷組織生長指數(shù)（表3），銀杏外植體采摘月份對愈傷組織生長影響不顯著；激素影響中NAA對愈傷組織生長有極顯著影響（P＜0.01），由低濃度升高時對愈傷組織生長有較大的促進作用，而KT濃度影響不顯著；VC對銀杏愈傷組織生長有抑制作用，且影響顯著（P＜0.05），根據(jù)4因素的R值可判定它們對愈傷組織生長指數(shù)影響的主次順序為：NAA濃度＞VC濃度＞外植體月份＞KT濃度，銀杏愈傷組織者最佳生長組合為A1B3C1D1。

表3 40 d時銀杏葉愈傷組織生長指數(shù)直觀分析

2.2 銀杏愈傷組織褐化指數(shù)分析

銀杏愈傷組織接種后，各試驗號每8 d進行愈傷組織形態(tài)觀察，計算各組愈傷組織褐化指數(shù)，繪制40 d內(nèi)銀杏愈傷組織褐化指數(shù)曲線如圖3。

據(jù)圖3，銀杏愈傷組織色澤在繼代后16 d左右開始由黃綠色出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，且32-40 d間褐化指數(shù)會大幅提升。截至40 d，褐化指數(shù)最高的為第5組51.88%，最低為第2組17.50%。

據(jù)表4結(jié)果顯示，4因素中VC濃度對褐化率影響極顯著（P＜0.01），VC濃度從5 mg/L到20 mg/L，褐化指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，當(dāng)VC濃度為10 mg/L時，平均褐化指數(shù)到達最低值22.71%；而其他3因素均對愈傷組織褐化無顯著影響（P＞0.05）。根據(jù)4因素的R值判定它們影響愈傷組織褐化率的主次順序為：VC濃度＞KT濃度＞外植體月份＞NAA濃度，在最優(yōu)組合為A1B1C2D2下，銀杏愈傷組織的褐化指數(shù)能達到最低。

圖3 銀杏愈傷組織褐化指數(shù)曲線

表4 40 d時銀杏葉愈傷組織褐化指數(shù)直觀分析

2.3 總黃酮含量分析

2.3.1 線性關(guān)系：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜（圖4），以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制槲皮素、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線（表5），根據(jù)相關(guān)系數(shù)r可知槲皮素、山奈酚、異鼠李素在濃度范圍為 3.75-60.00 μg/mL、3.75-60.00 μg/mL 及2.50-40.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 總黃酮苷對照品HPLC圖

2.3.2 銀杏葉片黃酮含量分析 根據(jù)4、5、6月中旬銀杏葉片黃酮含量趨勢（圖5），4月銀杏葉片黃酮含量為3個月份中的最低值8.90 mg/g；從4月中旬到6月中旬，銀杏葉片黃酮含量呈上升趨勢，以4月中旬到5月中旬為黃酮相對快速積累期，5月中旬到6月中旬黃酮積累減慢，在6月中旬葉片黃酮達到3個月份中的最高含量12.70 mg/g。

表5 三種黃酮醇苷的回歸方程與線性關(guān)系

圖5 銀杏葉片總黃酮含量

2.3.3 銀杏愈傷組織黃酮含量分析 根據(jù)圖6中銀杏愈傷組織黃酮含量及表6直觀分析，截至40 d，正交試驗中黃酮含量最高的第9組達到11.04 mg/g，而最低的第3組僅為6.31 mg/g；根據(jù)直觀與方差分析結(jié)果，愈傷組織黃酮含量隨外植體月份的延后而有顯著增長（P＜0.05）；激素中NAA對黃酮含量有極顯著影響（P＜0.01），KT濃度也對黃酮含量呈顯著影響（P＜0.05），在激素配比為2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT時愈傷組織黃酮積累量最大；而抗褐化劑VC濃度對黃酮積累的影響不顯著，但最低與最高濃度間仍有顯著差異。根據(jù)4因素的R值判定它們影響愈傷組織黃酮積累的主次順序為：NAA濃度＞葉片月份＞KT濃度＞ VC濃度，銀杏愈傷組織黃酮積累最優(yōu)組合為A3B2C2D1。

圖6 40 d時銀杏愈傷組織總黃酮含量

表6 40 d時銀杏愈傷組織總黃酮含量直觀分析

2.4 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量計算

以40 d時各組的平均愈傷組織干重（g/瓶）和總黃酮含量（mg/g）DW，計算各組的總黃酮實際產(chǎn)量（表7）。

直觀分析結(jié)果顯示，銀杏愈傷組織繼代培養(yǎng)40 d后，總黃酮產(chǎn)量最高的為第9組1.49 mg/瓶，最低為第7組0.83 mg/瓶。通過4因素的R值判定它們影響愈傷組織總黃酮產(chǎn)量的主次順序為：NAA濃度＞ VC濃度＞KT濃度＞葉片月份；由于細胞生長差異影響，銀杏愈傷組織中最佳黃酮積累條件并非適合生產(chǎn)黃酮，總黃酮產(chǎn)量的最佳組合為A2B2C1D1，即以5月份葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，在MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC條件下實際總黃酮產(chǎn)量達到最高。

3 討論

銀杏是藥用植物的開發(fā)熱點，穩(wěn)定高效地培養(yǎng)細胞，最大程度優(yōu)化培養(yǎng)條件是銀杏愈傷組織工業(yè)化生產(chǎn)黃酮的關(guān)鍵。植物細胞培養(yǎng)周期一般為20-40 d，本研究通過40 d的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷組織接種到新培養(yǎng)基后，會經(jīng)歷一段緩慢生長期，隨后在16 d左右進入快速上升期，32 d后生長開始變得平緩，褐化指數(shù)卻顯著升高，在32-40 d階段，褐化指數(shù)最高的第5組從23.13%上升至51.88%；認為在實際生產(chǎn)中銀杏愈傷組織的合適繼代周期為24-32 d之間，生長較快且不易褐化。

表7 銀杏愈傷組織總黃酮產(chǎn)量正交分析

愈傷組織的生長與次生代謝受外植體影響，以銀杏不同部位為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，黃酮含量表現(xiàn)為葉＞莖＞子葉［15］，同時房惠勇等［16］認為以原植物中次生代謝產(chǎn)物含量高的外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，繼代培養(yǎng)中也更易積累該產(chǎn)物。銀杏葉愈傷組織培養(yǎng)中，供試外植體一般取4-6月銀杏樹當(dāng)年生嫩葉，細胞全能性強，誘導(dǎo)率較高且不易染菌；本實驗通過研究4、5、6月中旬銀杏葉片誘導(dǎo)的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)隨著外植體月份的延后，其誘導(dǎo)的愈傷組織在繼代中生長指數(shù)降低，褐化指數(shù)增加，但總體差異不顯著；而銀杏愈傷組織中黃酮含量隨外植體采摘月份從4月到6月顯著升高，以6月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在40 d后黃酮含量達到平均最高值9.21 mg/g（DW）；對比4、5、6月中旬銀杏葉片發(fā)現(xiàn)，從4月到6月葉片黃酮含量同樣呈上升趨勢，認為銀杏愈傷組織的黃酮含量與其外植體本身呈正相關(guān)關(guān)系。

激素是植物愈傷組織生長與次生代謝的重要影響因子，在組織培養(yǎng)中，生長素與細胞分裂素間具有相互協(xié)同、拮抗等復(fù)雜的的調(diào)控關(guān)系，調(diào)節(jié)兩者的比值能達到不同的促進效果。崔剛等［17］發(fā)現(xiàn)，相較于2，4-D和6-BA，NAA和KT的組合更適合銀杏愈傷組織生長，且能提高繼代過程中銀杏細胞的葉綠素含量。本研究以NAA為生長素，KT為細胞分裂素，通過正交實驗發(fā)現(xiàn)激素中NAA濃度的增加會顯著提高愈傷組織繼代中的生長指數(shù)，在NAA 濃度為3.0 mg/L時愈傷組織40 d時平均生長指數(shù)可達到5.54，KT影響則不顯著；而HPLC結(jié)果顯示NAA與KT對愈傷組織中的黃酮含量都有顯著影響，且直觀分析顯示過低或過高的激素濃度均不利于黃酮積累，在本實驗正交設(shè)計組中，以6月葉片為外植體，在3.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+5 mg/L VC組合下40 d時黃酮含量可達到最高值11.04 mg/g（DW），與5、6月銀杏葉黃酮含量接近，高于4月銀杏葉。據(jù)Cheng等［11］報道，以銀杏胚芽為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，在MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA條件下繼代，45 d時黃酮含量為12.5 mg/g（DW）；而陳學(xué)森等［15］將繼代3個月的葉愈傷組織進行不同激素處理，發(fā)現(xiàn)在3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比下，40 d后黃酮含量可達23.7 mg/g（DW）；通過與前人實驗中銀杏愈傷組織黃酮含量差異對比，認為銀杏愈傷組織黃酮含量的影響因素是多元復(fù)合的，不僅受到激素種類和濃度影響，還受到種質(zhì)資源、取材樹樹齡、取材部位、抗褐化劑等因子共同作用。

褐化是銀杏愈傷組織繼代中的常見問題，主要是由于愈傷組織內(nèi)酚類物質(zhì)易與空氣中的氧結(jié)合形成醌類物質(zhì)，使愈傷組織色澤轉(zhuǎn)為褐色的同時阻礙細胞生長與代謝；合適的抗褐化劑能通過吸附或還原多酚，降低愈傷組織褐化率。VC是一類防氧化抗褐化劑，廣泛用于組培中的抗褐化研究，高紅兵等［18］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加VC能通過防止天女木蘭中的咖啡酸與綠源酸氧化，使其外植體褐化率由52.2%降至12.2%；本實驗中，培養(yǎng)基VC濃度由5 mg/L升高到10 mg/L時，銀杏愈傷組織平均褐化指數(shù)由45.00%降至22.71%，效果顯著（P＜0.05），是經(jīng)濟有效的愈傷組織抗褐化添加品。但研究同樣發(fā)現(xiàn)VC濃度升高到20 mg/L時會顯著抑制細胞的生長和黃酮積累，并提升褐化指數(shù)，猜測可能是高濃度VC降低了培養(yǎng)基PH，而培養(yǎng)基過酸或過堿都會阻礙細胞正常生長［13］，需要在實際生產(chǎn)應(yīng)用中嚴格控制濃度范圍。同時，本研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的VC雖然降低了愈傷組織褐化指數(shù)，但也降低了黃酮總產(chǎn)量，這其中的機理反應(yīng)，還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

本實驗通過誘導(dǎo)4、5、6月銀杏葉片形成愈傷組織，建立了穩(wěn)定的銀杏愈傷組織繼代體系。并發(fā)現(xiàn)銀杏愈傷的最佳繼代周期為24-32 d；最佳生長組合為4月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+3.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC；褐化指數(shù)最低的組合為4月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+10 mg/L VC，適宜在銀杏愈傷組織培養(yǎng)中長期繼代；最佳黃酮積累組合為：6月葉片誘導(dǎo)的愈傷組織+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+5 mg/L VC；結(jié)合愈傷組織干重與黃酮含量，發(fā)現(xiàn)不同于黃酮含量最高的條件，實際總黃酮產(chǎn)量最高的組合為5月葉片為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+5 mg/L VC，適合利用銀杏細胞生產(chǎn)黃酮。