徐引弟 ，王治方 ，張青嫻 ，朱文豪 ，李海利 ，焦文強(qiáng) ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）的病原，是一種豬的高度接觸性傳染性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為暴發(fā)性流行，以纖維素性、出血性、壞死性肺炎為特征，發(fā)病率在8.5%～100%，死亡率在0.4%～100%，是當(dāng)前導(dǎo)致育肥豬和種豬呼吸道疾病發(fā)病和突然死亡的主要原因，已在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。

胸膜肺炎放線桿菌血清型多達(dá)15種，且目前還有很多不能定型的臨床分離菌株，其流行率因地理區(qū)域而異，不同血清的毒力和免疫原性存在差異，國(guó)內(nèi)流行的血清型主要是 1，2，3，5，7 型，APP外毒素在致病與免疫中起著重要作用，APP一共有4種外毒素，即毒素ApxⅠ，ApxⅡ，ApxⅢ和 ApxⅣ，而且毒素ApxⅠ和ApxⅡ在APP毒力方面起著關(guān)鍵作用。不同血清型分泌的外毒素不一樣。血清1型能同時(shí)分泌毒素ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅣ，是所有血清型毒株中毒力最強(qiáng)、免疫原性最好的毒株，同時(shí)也是我國(guó)流行的一種優(yōu)勢(shì)血清型毒株[6-10]。因此，APP的分離鑒定和準(zhǔn)確的血清分型對(duì)于疫情診斷、疫情流行病學(xué)調(diào)查和該病的防治尤為重要。

本試驗(yàn)對(duì)河南省某規(guī)模化豬場(chǎng)突發(fā)育肥豬死亡的病例進(jìn)行了傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定和生物學(xué)特性研究，旨在為指導(dǎo)豬場(chǎng)科學(xué)及時(shí)防控該病、減少損失提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 其來(lái)源于河南省汝州市某大型養(yǎng)豬場(chǎng)疑似病例的育肥豬，發(fā)病豬高燒、體溫達(dá)42℃，口鼻流血，死亡很快，解剖肺臟充血出血嚴(yán)重，采集發(fā)病豬的肺臟、心血、關(guān)節(jié)及腦組織等。

1.1.2 主要試劑 動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒，DL2000 Marker，2×PCR Mix，50×TAE 濃縮液，新生牛血清購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；TSA（胰蛋白大豆瓊脂）、TSB（胰蛋白大豆肉湯）購(gòu)自BD公司；NAD（輔酶Ⅰ）購(gòu)自Roche公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 TSA固體培養(yǎng)基和TSB液體培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌采集病豬的肺臟、心血接種于TSA固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取圓形凸起、半透明、光滑、濕潤(rùn)的、側(cè)對(duì)光線有虹光以及直徑大小為1～2 mm的可疑菌落，革蘭氏染色在油鏡下觀察細(xì)菌，挑單菌落純化于TSA培養(yǎng)基上，同時(shí)將可疑菌落接種于不含NAD但含血清的TSA固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)情況以及形態(tài)大小。

1.2.3 鑒定

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，根據(jù)傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIV基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物P1，P2，用于傳染性胸膜肺炎放線桿菌的擴(kuò)增；同時(shí)根據(jù)傳染性胸膜肺炎放線桿菌莢膜CPS1B基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型的特異性引物P3，P4，用于傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型的擴(kuò)增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列列于表1。

表1 PCR擴(kuò)增HPS基因引物序列

1.2.3.2 APP的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（總體積25μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物 P1，P2各1 μL，模板（按照DNA提取試劑盒的操作步驟提取出的 DNA）1 μL，加入 ddH2O至 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3.3 血清型鑒定 參照1.2.3.2的方法，用APP1型的特異性引物P3，P4擴(kuò)增，將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序并用Blast比對(duì)。

1.2.4 毒力試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物為2月齡斷奶健康的保育豬8只。試驗(yàn)動(dòng)物分為2組：對(duì)照組4只，試驗(yàn)組4只。將鑒定的1型APP接種TSB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18 h后，連續(xù)10倍稀釋涂布TSA平板，活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算原液菌體濃度，調(diào)整至108cfu/mL，試驗(yàn)組動(dòng)物通過滴鼻感染3 mL 1型APP，對(duì)照組動(dòng)物通過滴鼻接種3 mL滅菌的TSB液體培養(yǎng)基。連續(xù)觀察14 d，并記錄其發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)等情況。

1.2.5 免疫原性試驗(yàn) 將分離的1型APP接種到TSB液體培養(yǎng)基，18 h后收取培養(yǎng)物，測(cè)定濃度，調(diào)整培養(yǎng)物中的菌數(shù)為2×109cfu/mL，每1 000 mL菌液加2 mL甲醛溶液，于37℃滅活12 h。滅活后的菌液按體積比1∶1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得傳染性胸膜肺炎放線桿菌滅活疫苗。

選取2月齡健康仔豬10頭，分為2組，每組5頭。疫苗組注射本疫苗2 mL，對(duì)照組為未免疫組，注射2 mL滅菌生理鹽水。疫苗組和對(duì)照組21 d后二免注射同等劑量的疫苗或滅菌生理鹽水。二免后14 d各組用109cfu的APP菌液采取滴鼻攻毒，觀察仔豬的臨床表現(xiàn)，并每天測(cè)定體溫，共觀察14 d。對(duì)死亡豬肺臟等器官進(jìn)行APP分離培養(yǎng)。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[13-14]，采用K-B藥敏紙片法，將純化的菌落均勻涂布于TSA平板上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌環(huán)的直徑，依據(jù)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，長(zhǎng)出一致的圓形凸起、半透明、光滑、濕潤(rùn)的直徑大小為1.0～1.5 mm的菌落，45°折射光下觀察具有明顯的金紅帶藍(lán)色虹光（圖1）；在不含NAD的TSA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。革蘭氏染色結(jié)果顯示，該菌為革蘭氏陰性菌，球桿菌、小桿菌、部分形成絲狀的菌體（圖2）。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 APP鑒定 對(duì)疑似APP的菌落進(jìn)行APP的擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶（圖3），測(cè)序結(jié)果顯示，與傳染性胸膜肺炎放線桿菌8392株ApxIVA 基因（GenBank No.AF188867）達(dá) 99.5%同源。

2.2.2 血清型鑒定 用1型APP的特異性引物P3，P4擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出959 bp大小片段（圖3），測(cè)序結(jié)果顯示，與1型傳染性胸膜肺炎放線桿菌4074株（GenBank No.AF518558）達(dá) 100%同源，證明分離菌株為1型APP。

2.3 毒力試驗(yàn)

試驗(yàn)組動(dòng)物在接種分離的1型APP 12 h后表現(xiàn)出呼吸困難等癥狀，體溫升高，耳部、腹部及臀部發(fā)紺，最后臥地不起，肌肉抽搐，窒息死亡，死前口鼻流出帶泡沫的血液；第2天死亡1頭，2 d后死亡3頭；對(duì)照組動(dòng)物在試驗(yàn)期間正常。試驗(yàn)結(jié)束后，剖殺試驗(yàn)組動(dòng)物和對(duì)照組動(dòng)物，采集病料，進(jìn)行APP分離。其中，試驗(yàn)組剖檢肺紫紅色，切面多汁，血色液體流出，氣管、支氣管充滿泡沫狀、血性黏液；對(duì)照組剖檢均未發(fā)現(xiàn)病理變化，對(duì)照組的4份病料均未分離到APP，而試驗(yàn)組的4份病料中均分離到APP，PCR鑒定結(jié)果與分離菌一致。

2.4 免疫原性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，疫苗組與未免疫組存在明顯的差異，攻毒后第2天，未免疫組的仔豬開始出現(xiàn)臨床癥狀，體溫升高，呼吸困難，開始出現(xiàn)死亡，死前口鼻流血，3 d內(nèi)共死亡5頭；剖檢未免疫組死亡豬肺臟腫大出血，氣管充滿血性泡沫物。而疫苗組的5頭仔豬沒有發(fā)病，無(wú)臨床癥狀，剖檢無(wú)明顯病變。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離的1型APP敏感的藥物有：頭孢哌酮、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢他定、頭孢氨芐、利福平、萬(wàn)古霉素。耐受的藥物有：多粘菌素、新霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、左氟沙星、阿奇霉素、四環(huán)素、壯觀霉素、紅霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、羅紅霉素、林可霉素、痢特靈、桿菌肽、呋喃唑酮、氨曲南、苯唑西林、哌拉西林、青霉素、氯霉素。

3 討論

本試驗(yàn)分離的菌株1型APP分離自發(fā)生典型呼吸困難急性死亡的育肥豬的心臟，在TSA固體培養(yǎng)基上分離時(shí)無(wú)其他細(xì)菌生長(zhǎng)，只有傳染性胸膜肺炎放線桿菌生長(zhǎng)，而且經(jīng)鑒定為毒力最強(qiáng)的1型。動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，本試驗(yàn)分離的菌株1型APP對(duì)保育豬具有較強(qiáng)的致病力，引起保育豬發(fā)病死亡，而且具有良好的免疫原性，免疫后對(duì)強(qiáng)毒的攻擊具有完全的免疫保護(hù)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離的APP主要對(duì)頭孢類抗生素敏感，對(duì)其他藥物多耐藥，與已有研究報(bào)道結(jié)果相近[13-19]。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)未發(fā)病豬接種1型APP疫苗，對(duì)發(fā)病豬敏感藥物治療，及時(shí)地控制了疫情，減少了損失。