石江鵬 ，張春芬 ，鄧 舒 ，侯麗媛 ，肖 蓉 ，李芙蓉 ，董艷輝 ，聶園軍 ，曹秋芬 ，

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業(yè)科學院果樹研究所，山西太原030031；3.山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031；4.山西省農業(yè)科學院農業(yè)資源與經濟研究所，山西太原030031）

蘋果為溫帶水果的一種，大多數(shù)溫帶水果的特點是育種周期長，童期長達5～7 d，高度雜合且異花授粉，通過傳統(tǒng)育種手段改變性狀遺傳信息需要花費大量的時間，育種目標也具有隨機性[1]。單倍體育種是現(xiàn)代育種的一項重要手段，通過雄核離體培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)）和雌核離體培養(yǎng)（未授粉子房或胚珠、輻照花粉培養(yǎng)等）等方法誘導產生具有單套染色體的單倍體植株，再利用秋水仙素誘導等方法進行染色體加倍形成雙單倍體（Double Haploid，DH）純合再生株系，可提高育種效率、擴大親本選擇范圍、減少基因重組數(shù)量[2]。單倍體和雙單倍體作為基礎研究材料，在突變的研究中可用于篩選隱性突變體，可以提高遺傳分析、圖譜構建、基因定位的效率及降低基因組測序成本[3]。單倍體育種豐富了種質資源，加快了育種進程，在科學研究中具有重要意義[4]。

果樹花藥培養(yǎng)開始于20世紀70年代，目前已在梨[5]、棗[6]、柑橘[7]、草莓[8]等多種植物中獲得了成功應用。1981年，國內獲得了黃太平、元帥蘋果花藥培養(yǎng)再生植株[9-10]。TSUKUNI等[11]和 OKADA 等[12]成功獲得蘋果花藥培養(yǎng)再生植株后，利用SSR分子標記技術檢測再生植株來源，并對純合再生株系進行形態(tài)學觀察。H?FER等[13]經過多年研究得出，蘋果花藥培養(yǎng)所得純合再生植株與雜合供體相比結實率較低，且形態(tài)特征發(fā)生了改變。在此基礎上，ZHANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，處于單核晚期或雙核早期的小孢子可顯著提高蘋果花藥培養(yǎng)胚狀體誘導率，對花藥進行4℃低溫預處理20～30 d，胚狀體誘導率呈上升趨勢。羅慧珍等[15]通過轉錄組測序的方法分析低溫誘導對蘋果花藥基因的調控，結果表明，蔗糖、淀粉生物合成、植物激素信號轉導相關基因的表達變化是影響小孢子獲得胚性潛能的關鍵。溫鑫等[16]利用流式細胞儀對蘋果花藥離體培養(yǎng)獲得再生植株進行倍性分析，再選用蘋果SSR（HIDRAS）標記鑒定再生植株基因型，經檢測，再生株系全部為純合基因型，包括單倍體、二倍體、四倍體。

國內外有關蘋果花藥培養(yǎng)的研究不斷發(fā)展，但關于蘋果花藥培養(yǎng)再生植株移栽技術的相關研究報道尚未得到大量有效的驗證，因此探究蘋果花藥培養(yǎng)試管苗的移栽條件可以更好地選出優(yōu)良的蘋果新種質。

本研究以丹霞蘋果花藥培養(yǎng)的8個純合再生株系為材料[16-18]，每個純合再生植株均由不同的花粉粒分化而來，因此，不同的株系根系生長狀態(tài)、葉片形態(tài)特征具有差異性。通過對每個株系試管苗的根系生長特性、葉片形態(tài)特征進行觀察分析，選出具有優(yōu)良性狀的株系，對蘋果種質資源創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采集山西省農業(yè)科學院果樹研究所蘋果基地的丹霞蘋果品種的健壯花蕾，將其經低溫預處理、消毒，在無菌操作臺中將花藥接種于胚狀體誘導培養(yǎng)基（N6＋2.0～3.0 mg/L 6-BA＋0～0.15 mg/L NAA），于25℃在恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。將長至1 cm左右的胚狀體轉入胚狀體分化培養(yǎng)基（MS＋1.0～5.0 mg/L6-BA＋0.1～0.3 mg/LIBA＋3%蔗糖＋0.6%瓊脂），20 d左右分化出幼芽。經繼代培養(yǎng)獲得再生植株[1]。本研究以丹霞蘋果純合基因型DH3-1，DH3-2，DH3-3，DH3-4，DH3-5，DH3-6，DH3-7，DH3-8株系為材料[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 根系的誘導及測定 從繼代組培苗中選取生長旺盛的再生植株接種于生根誘導培養(yǎng)基（1/2 MS＋2.0 mg/LIBA＋2%蔗糖＋0.6%瓊脂）。每個株系接種15株，置于溫室光照培養(yǎng)（25℃3 000 lx；光照14h，黑暗10 h；相對濕度70%），40 d后選取5個植株用鑷子挑選出培養(yǎng)基中的全部根系，觀察并測定根的長度和根的數(shù)量，拍照記錄。

1.2.2 葉片性狀的觀察及測定 從生根試管苗中選取葉片充分展開和成熟的植株（莖中部葉片），每個株系取5個植株，每株選取3個葉片，每個株系共測量15個葉片。將葉片用清水洗干凈后鋪平放入含有濾紙的自封袋中，注明株系號。測量每個葉片的葉長度、葉寬度（最大葉寬度）、葉柄長度。計算葉形指數(shù)（葉長度/葉寬度）。觀察葉色、葉緣變異，并拍照。觀察記載方法參照《果樹種質資源描述符：記載項目及評價標準》[19]進行。

1.2.3 再生植株移栽技術研究 選擇生根培養(yǎng)基上生長茁壯的苗，即葉色濃綠，根系發(fā)達，以在組培瓶中株高較高的為佳。將組培苗進行煉苗，煉苗方法設2個處理，分別為開蓋后直接移栽和溫室中閉蓋放置5～7 d，開蓋加入蒸餾水放置2～3 d后移栽，每個處理5個植株。移栽時先把基質（草炭∶蛭石∶珍珠鹽為1∶1∶1）裝至盆的4/5，將取出的試管苗在清水中洗凈根部殘留的瓊脂后移栽進基質中，立即用清水澆透，并罩上透明杯，注明移栽日期和株系號。置于光照培養(yǎng)箱，15 d后去掉透明杯，每周澆一次營養(yǎng)液（1/2MS＋2 mg/LIBA）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行原始數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，使用SPSS 20.0軟件對不同處理進行多重比較、單因素方差分析，顯著性水平設定為α＝0.05，圖表中所有數(shù)據(jù)均為3個重復的平均數(shù)±標準誤。

2 結果與分析

2.1 不同株系根系形態(tài)特征分析

通過對丹霞蘋果純合基因型株系的根系形態(tài)進行分析（表 1、圖 1），結果表明，DH3-8，DH3-4 株系的根數(shù)、根長顯著高于其他6個株系（P＜0.05），根長分別為26.53，27.70 cm，根數(shù)分別為39.00，51.67 個（圖 1-A，B）；DH3-1，DH3-3，DH3-6 株系的根長、根數(shù)無顯著差異（P＞0.05），與 DH3-4，DH3-8相比顯著減小，根長為16.67～20.50 cm，根數(shù)為13.33～15.33 個（圖 1-C～E）；DH3-2，DH3-5，DH3-7株系的根長、根數(shù)與其他5個株系相比顯著較?。≒＜0.05）（圖 1-F～H），其中，DH3-7 株系根長、根數(shù)最小，分別為7.67 cm，4.33個（圖1-H）?？梢?，丹霞蘋果純合基因型8個株系的根系形態(tài)特征具有差異性，DH3-4，DH3-8株系根的生長狀態(tài)較好。

表1 丹霞蘋果純合基因型株系根系形態(tài)特征

2.2 不同株系葉片形態(tài)特征分析

從表2可以看出，丹霞蘋果純合基因型株系的葉片形態(tài)特征如葉片寬度、葉片長度、葉柄長度具有明顯差異，DH3-3，DH3-4株系的葉片寬度較寬，分別為 1.90，1.73 cm（圖 2-A，B），顯著寬于其他株系；DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5 株系間葉片寬度無差異（圖2-C～F），但顯著寬于DH3-2株系，DH3-2株系葉片寬度僅為1.00cm（圖2-H）。DH3-7株系的葉片長度顯著較短，為1.83 cm（圖2-G），但與其他7個株系的葉片長度未達到差異顯著水平。不同株系具有不同的葉柄長度，DH3-3，DH3-8株系的葉柄長度較長，分別為1.30，1.37 cm（圖2-A，C），DH3-2株系的葉柄長顯著最短，為0.47cm（圖2-H）。葉形指數(shù)在不同株系間表現(xiàn)差異顯著，DH3-6株系的葉形指數(shù)顯著較大，表明葉片為窄長形（圖2-E），DH3-3株系的葉形指數(shù)顯著最小，表明葉片呈闊圓形（圖2-A），DH3-1，DH3-5株系的葉形指數(shù)差異不顯著，二者的葉片形狀相似（圖2-D，F(xiàn)）。

表2 丹霞蘋果純合基因型株系葉片形態(tài)特征比較

葉緣、葉色、葉片形狀等的變異，不同的株系表現(xiàn)不一致。DH3-3株系葉基為楔形（圖2-A），DH3-4株系為寬楔形（圖2-B），而DH3-6株系的葉基為偏斜（圖 2-E）；從葉尖來看，DH3-4，DH3-7株系的葉尖為銳尖（圖 2-B，G），DH3-3，DH3-8，DH3-6 株系的為漸尖 （圖 2-A，C，E），DH3-1，DH3-5株系為突尖（圖2-D，F(xiàn)），DH3-2株系葉尖呈撕裂狀（圖2-H）；分析每個株系的葉片形狀，DH3-3，DH3-4株系葉片形狀為卵形（圖2-A，B），DH3-8，DH3-1，DH3-6，DH3-5，DH3-7 為 橢 圓 形（圖2-C～G），DH3-2為畸形葉片（圖2-H）；不同株系葉緣鋸齒的變異也表現(xiàn)出多樣性，DH3-3株系為圓齒狀（圖2-A），DH3-8，DH3-6株系為鋸齒狀（圖2-C，E），DH3-4，DH3-2 株系為重鋸齒狀（圖 2-B，H）；就葉色而言，DH3-3，DH3-4，DH3-1 株系葉色較深（圖 2-A，B，D）。

綜上所述，DH3-3，DH3-4，DH3-8 株系的葉片寬度、長度、葉柄長度優(yōu)于其他株系，所以，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的綜合性狀較好。丹霞蘋果純合基因型株系的葉基、葉尖、葉片形狀、葉緣、葉色具有差異性，就葉片的形態(tài)而言，每個株系均具有唯一性。

2.3 再生植株移栽分析

丹霞蘋果純合基因型株系移栽過程如圖3所示。溫室中閉蓋放置5～7 d，開蓋加入蒸餾水放置2～3 d，植株在煉苗過程中死亡（圖3-A），沒有株系成活。開蓋后直接移栽植株生長狀態(tài)較好（圖3-B，C），有3個株系成活，成活率達到37.50%。

3 討論

蘋果花藥培養(yǎng)是指將發(fā)育到一定階段的花藥在消毒處理后接種到人工培養(yǎng)基上，花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株有2種途徑：一是花藥改變原來的發(fā)育過程直接形成胚狀體，經培養(yǎng)后形成再生植株（胚胎發(fā)生系統(tǒng)）；二是誘導花藥增殖形成愈傷組織，再誘導分化成胚狀體，繼而形成單倍體植株（器官發(fā)生途徑）。由于受花粉壁等體細胞的干擾，所以通過花藥培養(yǎng)技術獲得的再生植株可能是雜合植株，因此，花藥培養(yǎng)再生植株需要經同工酶、S等位基因、分子標記等方法進行純合性鑒定。H?FER等[20]選用磷酸葡萄糖異構酶（PGI）、蘋果酸脫氫酶（MDH）對蘋果花藥培養(yǎng)再生植株進行同工酶分析，經鑒定獲得的植株均為單倍體來源。SSR分子標記法目前應用較為廣泛，H?FER等[13]通過SSR標記證明，Pirina，Rene蘋果花藥培養(yǎng)再生新種質的純合性。溫鑫等[16]利用來自HISDAS的130個SSR標記對嘎啦、丹霞、富士3個蘋果品種的花藥培養(yǎng)再生植株進行PCR，篩選出可區(qū)分再生植株為純合基因型的SSR標記。本研究丹霞的8個花藥培養(yǎng)再生植株經SSR鑒定均為純合基因型[16-17]。

VANWYNSBERGHE等[21]研究表明，蘋果花藥來源純合基因型株系生長較慢，部分品系發(fā)生異常分枝，花粉發(fā)芽率差，果實顯著變小。H?FER等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與供體植株相比，蘋果花藥來源的植株移栽到田間后樹和花的形態(tài)學發(fā)生改變。本研究中，丹霞蘋果純合基因型8個株系的根系形態(tài)特征、葉片形態(tài)特征表現(xiàn)出明顯差異。DH3-4，DH3-8株系的根數(shù)最多、根長最長，DH3-1，DH3-3，DH3-6株系的根長、根數(shù)次之。DH3-3，DH3-4，DH3-8株系的葉片寬度、長度、葉柄長度優(yōu)于其他株系。不同株系的葉緣、葉色、葉片形狀等也存在差異，其中，如DH3-3株系葉基為楔形、葉片形狀為卵形、葉色較深、葉緣鋸齒為圓齒狀；DH3-4株系葉基寬楔形、葉尖為銳尖，葉片形狀為卵形、葉色較深、葉緣鋸齒為重鋸齒狀；DH3-8株系葉基為楔形、葉尖為漸尖，葉片形狀為橢圓形、葉緣為鋸齒狀。蘋果花藥來源株系表型多樣性可能是由于潛在隱性基因表達，每個株系含有不同的基因型，進而表現(xiàn)出不同的性狀[20]。

本研究進行煉苗時采用2種方法，分別為開蓋后直接移栽和溫室中閉蓋放置5～7 d，開蓋加入蒸餾水后放置2～3 d移栽。其中，開蓋后直接移栽成活株系為3株，成活率達到37.50%；溫室中閉蓋放置5～7 d，開蓋加入蒸餾水后放置2～3 d移栽，成活率為0。開蓋后直接移栽比開蓋放置2～3 d后移栽成活率高，可能是由于開蓋放置2～3 d的過程中，瓶蓋去掉后葉片水分嚴重散失而導致植株很快枯萎，若只將蓋擰松而不全部去掉，培養(yǎng)基霉菌繁殖致使植株死亡。開蓋后直接移栽到含有草炭、蛭石、珍珠鹽的基質中，然后在剛移栽的植株外罩上透明杯，可以避免霉菌繁殖，減少植株水分散失。謝璇等[22]以紅富士蘋果組培苗為試材，采用水培煉苗的方法，即將組培苗閉瓶培養(yǎng)在改良的霍格蘭德營養(yǎng)液中（霍格蘭德配方用量減少1/2[23]），室內自然光下培養(yǎng)14 d后，再用改良的霍格蘭德全營養(yǎng)液開瓶煉苗21 d后移栽，這種方法提高了移栽成活率。也有研究表明，水培煉苗可避免培養(yǎng)基干裂、霉菌過多繁殖，鍛煉組培苗根系的吸水能力，使移栽成活率提高[24-25]。

4 結論

丹霞蘋果花藥培養(yǎng)獲得的8個純合基因型株系中，DH3-3，DH3-4，DH3-8株系優(yōu)于同一品種其他株系（根系較長、數(shù)量較多，葉片寬度、長度、葉柄長度較長）。丹霞蘋果純合基因型株系的葉緣、葉色、葉尖、葉基、葉片形狀表現(xiàn)出明顯差異。丹霞蘋果純合基因型株系不經過煉苗而直接移栽植株生長狀態(tài)更好。