趙 璇，張耀文

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

綠豆（Vigna radiata）是我國(guó)傳統(tǒng)的栽培作物，屬于豆科蝶形花亞科紅豆屬。綠豆作為醫(yī)食兩用作物，受到世界各國(guó)人民的歡迎[1]。

近年來，綠豆的育種研究越來越受到重視[2]，其選育優(yōu)良新品種的常用方法是雜交。對(duì)綠豆雜交后代的真假雜種鑒定一直采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)辨別法，這種方法需要后代與親本的生理特征作對(duì)比，準(zhǔn)確性易受生長(zhǎng)環(huán)境等外界因素影響，且周期較長(zhǎng)[3]。

目前，分子標(biāo)記在綠豆基因組學(xué)的研究中應(yīng)用越來越廣泛[4]，其中較為常見的就是SSR標(biāo)記，該標(biāo)記具有均勻覆蓋基因組、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)綠豆F1真假雜種進(jìn)行鑒定，時(shí)間短，準(zhǔn)確性高。

本試驗(yàn)利用SSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)綠豆雜交組合的F1幼苗進(jìn)行鑒定，通過田間表型性狀鑒定來進(jìn)行驗(yàn)證，旨在確定SSR標(biāo)記鑒定綠豆雜種的可行性，為綠豆育種工作提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

6個(gè)親本材料為冀綠9號(hào)[6-7]（黑色種皮）、晉綠豆3號(hào)[8]（綠色種皮）、BIS9805（綠色種皮）、白綠10號(hào)（綠色種皮）、資源331[9]（黃色種皮）、資源330（黃色種皮）。

6個(gè)雜交組合為冀綠9號(hào)×?xí)x綠豆3號(hào)（正反交）、白綠10號(hào)×冀綠9號(hào)（正反交）、冀綠9號(hào)×資源330（正反交）、冀綠9號(hào)×BIS9805（正反交）、資源330×?xí)x綠豆3號(hào)（正反交）、資源331×?xí)x綠豆3號(hào)（正反交）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 親本材料于2018年種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所食用豆課題組實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置5粒種子，出苗后取2～3片嫩葉，用于改良CTAB法提取DNA[10-11]。雜交后代F1種植于東陽(yáng)大田，出苗后取嫩葉，提取DNA。具體步驟為：（1）水浴鍋預(yù)熱65℃。（2）嫩葉置于2.0mL離心管內(nèi)，加入液氮研磨。（3）在研磨好的葉樣中加入18μL的β-巰基乙醇并混勻，再加入0.8 mL的CTAB混合提取液，旋渦振蕩1 min，預(yù)熱好的水浴鍋中水浴1h。（4）加入0.8mL的氯仿/異戊醇（V/V＝24∶1）溶液，15 min混勻。（5）10 000 r/min離心10 min，取上清，加入95%的乙醇0.9 mL，輕輕搖晃2min后，-20℃冰箱冷凍0.5h。再10000r/min離心10 min，棄上清，將沉淀保留。室溫干燥后，加入0.2mL的超純水，-20℃保存。

1.2.2 PCP反應(yīng) PCR反應(yīng)體系（10 μL）：DNA 模版 1.5 μL（25 μmol/L），10×Taq buffer 1 μL，DNTP 0.2 μL，10×Taq DNA 聚合酶 0.12 μL，SSR 引物（20 μmol/L）0.75 μL，ddH2O 6.48 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；各引物相應(yīng)的退火溫度退火30 s；72℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠檢測(cè) 把2 μL的Londing buffer加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中混合均勻，利用8%的聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，AgNo3染色，甲醛顯色后拍照記錄。

1.2.4 SSR分子標(biāo)記的篩選 利用6個(gè)親本材料，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的100對(duì)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，篩選出帶型清晰、差異明顯的SSR分子標(biāo)記[12]。

1.2.5 雜種鑒定 用篩選出來的SSR標(biāo)記對(duì)F1DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，親本帶型都具有的則為真雜種。

1.2.6 田間種皮色鑒定 將雜交后代F2群體種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院臨汾基地，成熟后觀察其種皮色是否發(fā)生分離。若種皮色發(fā)生分離，確定真雜種；若種皮色未發(fā)生分離，確定為假雜種[13-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記親本初篩結(jié)果

通過對(duì)6個(gè)親本材料的多態(tài)性分析（圖1），挑選出了 5個(gè)多態(tài)性較好的SSR引物（E15212，E52717，G27240，G3202，Vr2-436），具體如表 1[16]所示。

表1 SSR引物序列

2.2 F1真假雜種鑒定

通過挑選出來的5個(gè)SSR引物對(duì)食用豆課題組提取的6個(gè)組合的43個(gè)F1后代進(jìn)行鑒定，一個(gè)組合由2對(duì)引物重復(fù)鑒定，結(jié)果如表2[17]所示。F1為真雜種的，同時(shí)具有親本的帶型（圖2）[18]。

表2 F1真假雜種鑒定結(jié)果

2.3 田間種皮色鑒定結(jié)果

王麗俠等[19-21]研究表明，不同種皮色的雜交后代會(huì)出現(xiàn)分離。本次試驗(yàn)選取了不同種皮色的親本配制雜交組合，收取F2種子后脫粒，對(duì)其顏色進(jìn)行調(diào)查。F2種子出現(xiàn)分離的為真雜種，未出現(xiàn)分離的記為假雜種。在冀綠9號(hào)×資源330組合的7個(gè)雜交莢后代中，有5個(gè)后代出現(xiàn)了黃種皮與黑種皮的分離，有1個(gè)后代均為黑種皮，1個(gè)后代均為黃種皮。田間種皮色鑒定結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果一致[22]。

3 結(jié)論與討論

綠豆雜種鑒定通常采用葉片結(jié)構(gòu)、株型差異等形態(tài)標(biāo)記來作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。這種傳統(tǒng)的鑒定方法都需要比較親本與后代的差異，所以，周期較長(zhǎng)，并且容易受到生長(zhǎng)環(huán)境等外界因素的影響，造成很大的誤差。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)綠豆的真假雜種進(jìn)行鑒定，不僅鑒定時(shí)間短、不受環(huán)境影響，又是利用分子技術(shù)從遺傳角度進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確度高，結(jié)果更真實(shí)可靠。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在綠豆研究的各個(gè)領(lǐng)域被廣泛使用[23-25]。本試驗(yàn)通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)綠豆種皮色雜交組合后代進(jìn)行雜種鑒定，其結(jié)果準(zhǔn)確性由2個(gè)SSR引物鑒定1個(gè)組合的對(duì)照組來確保；田間后代種皮色的分離統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與實(shí)驗(yàn)室SSR鑒定結(jié)果相一致。綜上所述，通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定綠豆真假雜種與傳統(tǒng)鑒定相比，不僅準(zhǔn)確，優(yōu)點(diǎn)更多，可以廣泛使用。