雷代麗，雷瑛彤，張 琳，張陽璞，鄧西平，楊淑慎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.中國科學(xué)院水利部水土保持研究所，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界范圍內(nèi)種植最廣的糧食作物之一，它為人類提供了超過20%的熱量和蛋白質(zhì)，以及豐富的礦質(zhì)元素等。但近年來溫室效應(yīng)及土地鹽堿化問題越來越嚴(yán)重，小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量受到了嚴(yán)重的威脅[1]，現(xiàn)有小麥品種已經(jīng)難以滿足人們對高品質(zhì)小麥日益增長的客觀需求。培養(yǎng)高抗的優(yōu)良作物品種一直是育種專家們研究的重點(diǎn)。但傳統(tǒng)的雜交育種方法無法避免育種周期長、雜交困難及無法獲得優(yōu)良性狀的小麥品種等難題[2]。目前，小麥抗逆新品種的培育也因基因庫的匱乏和方法的局限而落后于其他農(nóng)作物。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，深入探索小麥生理生化特點(diǎn)，在分子水平上挖掘小麥抗逆基因、了解其抗逆機(jī)制，借助基因工程手段將抗性基因?qū)胄←?，培育具有?yōu)良性狀的抗旱、高產(chǎn)、高營養(yǎng)價值的品種是解決當(dāng)今糧食短缺的根本途徑之一[3]。

目前基因槍介導(dǎo)法是應(yīng)用最廣的植物轉(zhuǎn)化方法之一，其原理是利用金屬微粒將其上攜帶的外源基因高速射入受體細(xì)胞，外源基因隨機(jī)插入受體細(xì)胞基因組并整合，最終得以表達(dá)。Vasil等[4]首次利用基因槍介導(dǎo)法將草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)導(dǎo)入小麥品種Pavon，獲得了世界上第一批轉(zhuǎn)基因小麥植株，為開展小麥分子育種奠定了基礎(chǔ)。隨后，Weeks等[5]利用基因槍介導(dǎo)法分別將β-葡萄糖苷酸標(biāo)記基因(gus)、bar基因?qū)肓诵←?，初步建立了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。據(jù)統(tǒng)計(jì)，隨著基因槍法在單子葉植物方面的轉(zhuǎn)化技術(shù)越來越成熟，該法已占到小麥遺傳轉(zhuǎn)化的68.8%[6]。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 是一種高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，幾乎在所有組織和器官中均能穩(wěn)定表達(dá)。它在真核生物和原核生物的細(xì)胞中占有10%～20%的蛋白總量，因其表達(dá)的穩(wěn)定性，它常被人們選作內(nèi)參進(jìn)行研究[7]。然而越來越多的研究表明，GAPDH在植物生長發(fā)育及抗逆性等諸多方面都發(fā)揮著多元化的功能。在植物基礎(chǔ)代謝方面，GAPDH參與植物碳水化合物(如糖類[8]和油脂[9])的積累，以及種子成熟和細(xì)胞程序性死亡過程[10]；在植物生長和形態(tài)學(xué)方面，gapc1和gapc2的缺失會造成植物根系發(fā)育受阻、植株矮小和雄性不育等癥狀[11]；在植物抗逆方面，過表達(dá)GAPDH能夠增強(qiáng)植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)能力[12]。此外，GAPDH能通過降低過氧化物的方式減輕高鹽對植物的毒害[13]，這種抗鹽功能可能與GAPDH能和參與鹽脅迫的第二信使磷脂酸(phosphatidic acid,PA)相互作用有關(guān)[14]。

同時，有研究發(fā)現(xiàn)，用PEG處理抗旱小麥品種長武134后，植株大量表達(dá)分子量約為39.5 kD的GAPDH蛋白[15]。隨著小麥基因組數(shù)據(jù)庫日趨完整，Zeng等[16]在小麥基因組中共發(fā)現(xiàn)22個TaGAPDH基因亞型，除去其中3個編碼非磷酸化蛋白的TaGAPN，共有13個基因亞型能夠編碼具有完整結(jié)構(gòu)域的蛋白。TaGAPDH8基因便是其中特殊的一個，該基因長1 690 bp，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子，其開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)編碼一個由337個氨基酸組成、分子量為36.61 kD、pI為 6.67的磷酸化蛋白(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)。張 琳[17]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的TaGAPDH8基因會被某些脅迫大量誘導(dǎo)表達(dá)。本研究選擇廣泛種植于陜西和甘肅地區(qū)的抗旱小麥品種長武134和干旱敏感小麥品種鄭引1號為材料，采用基因槍法建立這兩個品種的轉(zhuǎn)基因體系，并獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的T3代株系，以期為進(jìn)一步研究TaGAPDH8基因的生物學(xué)功能提供技術(shù)支撐和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為抗旱品種長武134(CW134)和干旱敏感品種鄭引1號(ZY1)，由中國科學(xué)院水利部水土保持研究所提供。干擾表達(dá)載體pTCK303-RNAi由張 琳[17]提供，該載體中正義片段(Fragment1)和反義片段(Fragment2)之間由水稻內(nèi)含子(rice intron)隔開。過表達(dá)載體pTCK303-TaGAPDH8由張陽璞[18]提供，該載體中SacI和SpeI兩酶切位點(diǎn)之間的序列由TaGAPDH8基因編碼序列代替。

1.2 培養(yǎng)基

本研究所用培養(yǎng)基類型及配方如下：誘導(dǎo)/恢復(fù)培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-12,4-D+500 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖；高滲培養(yǎng)基：誘導(dǎo)/恢復(fù)培養(yǎng)基+0.2 mol·L-1甘露醇+0.2 mol·L-1山梨醇；分化培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-1玉米素+0.5 mg·L-1激動素+25 mg·L-1潮霉素+30 g·L-1蔗糖；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+25 mg·L-1潮霉素+15 g·L-1蔗糖。在每種培養(yǎng)基中加入7 g·L-1瓊脂粉,pH 調(diào)節(jié)為5.8，高溫高壓滅菌。其中水解酪蛋白、玉米素(solarbio)、潮霉素(solarbio)經(jīng)過濾除菌，再加入滅菌后溫度降至50 ℃左右的培養(yǎng)基中。

1.3 小麥愈傷組織的誘導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化

參考池青等[19]的方法對小麥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)14～21 d，再于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)28～35 d。將分化出的幼苗轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，在幼苗根長2～3 cm時轉(zhuǎn)入4 ℃培養(yǎng)箱春化30 d，再移栽入花盆中培養(yǎng)。

1.4 再生植株的PCR鑒定與后代種植

待T0代再生植株長至三葉一心期，利用CTAB法提取潮霉素抗性小麥的基因組DNA，以檢測載體序列上的潮霉素抗性基因(491 bp)，引物序列為Fhyg：5′- TACTCTACACAGCCAT CGGGTCCAG，Rhyg：5′-ACTGGCAAA CTGT GATGGACGAC，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR體系和程序參考2×TaqMasterMix(近岸蛋白，上海)說明書進(jìn)行，其中退火溫度為57 ℃，循環(huán)數(shù)為35，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

選擇PCR陽性植株單穗收取種子并做好標(biāo)記，晾干后播種，將T1和T2代小麥種植后分別進(jìn)行PCR檢測，檢測方法同T0代植株，收獲T3代小麥種子。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的生長情況比較

隨機(jī)挑取大田T2代轉(zhuǎn)基因小麥和普通小麥植株，于乳熟期測量株高和穗長，收獲期測量穗粒數(shù)和千粒重。測量方法參照李立會[20]的標(biāo)準(zhǔn)，株高為地上部分長度(不包括芒)，每組測5株；穗長為穗基部至頂部(不包括芒)，每組測5穗；隨機(jī)挑出1 000粒種子并稱重計(jì)算千粒重，重復(fù)3次。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR鑒定

選取大小一致的T3代轉(zhuǎn)基因小麥和對照組小麥種子，用0.1%的HgCl2消毒15 min，無菌水沖洗數(shù)次后浸泡16～20 h，腹溝向下平鋪在鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加蒸餾水室溫中黑暗萌發(fā)1 d，10 h光照/14 h黑暗條件下培養(yǎng)14 d后取樣。將樣品于液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱中保存。用Trizol(TaKaRa，日本)提取植株總RNA，并按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)TaGAPDH8基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(FGAPDH8：5′-CCACC AGCCGTCCCACAATA，RGAPDH8：5′-GAACC AATCTCCCAATCCGTC，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為207 bp)，以小麥β-Actin基因(GenBank 注冊號：AB181991)為內(nèi)參(引物為Factin：5′-CGACTCTG GTGATGGTGTGAG,Ractin：5′-AGCAAGGTCC AAACGAAGGA，擴(kuò)增片段長度為85 bp)，使用CFX 96 Touch Real-time PCR Dectection System(Bio-Rad,美國)，按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，日本)說明書進(jìn)行qRT-PCR。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達(dá)水平。用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因槍法轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織及再生植株的結(jié)果

用含有目的基因和篩選標(biāo)記基因Hyg的干擾載體和過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化1 000個CW134愈傷組織和1 000個ZY1愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選，最終移栽成活15株CW134幼苗(圖1A),植株再生率為1.5%，經(jīng)PCR鑒定陽性植株為9株(圖2A)，陽性植株轉(zhuǎn)化率為0.9%；獲得ZY1再生苗23株(圖1B)，植株再生率為4.6%，經(jīng)PCR鑒定陽性植株為13株(圖2B)，陽性植株轉(zhuǎn)化率為2.6%。

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因小麥鑒定

對長武134和鄭引1號T1代植株進(jìn)行PCR鑒定，分別獲得5株和9株陽性植株(圖3)，最終將收獲種子的4個長武134株系和8個鄭引1號株系分別命名為CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13以及ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17。

2.3 T2代轉(zhuǎn)基因小麥在大田的生長狀況比較

將T1代轉(zhuǎn)基因小麥種子種植到大田，測量乳熟期小麥的株高、穗長、千粒重和穗粒數(shù)。在RNA干擾株系中，與對照相比，CW134-6和CW134-12的千粒重極顯著(P<0.01)提高，株高顯著(P<0.05)降低；CW134-13的穗長顯著(P<0.05)降低。在過表達(dá)株系中，與對照相比，ZY1-10的穗長、千粒重和穗粒數(shù)極顯著(P<0.01)提高，株高顯著(P<0.05)降低；ZY1-1和ZY1-3的穗長、千粒重和穗粒數(shù)極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)提高，株高顯著(P<0.05)增加；其余5個株系也都至少有2個性狀與對照的差異達(dá)到了顯著水平。

A：轉(zhuǎn)基因CW134；B：轉(zhuǎn)基因ZY1。 A:Transgenic plants of CW134;B:Transgenic plants of ZY1.

圖1轉(zhuǎn)基因小麥植株

Fig.1Wheattransgenicplant

1：長武134的陰性植株；2～6：長武134的陽性植株；7～12:鄭引1號的陽性植株；M:DL2000 DNA marker。

1:Negative plant of CW134;2-6:Positive plants of CW134;7-12:Positive plants of ZY1;M:DL2000 DNA marker.

圖2長武134(A)和鄭引1號(B)部分T0代轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果

Fig.2PCRdetectionresultsofT0generationplantsofCW134(A)andZY1(B)

1～3和5～10：鄭引1號的陽性植株；4：鄭引1號的陰性植株；11、12、14、15、17：長武134的陽性植株；13、16、18：長武134的陰性植株；M：DL2000 marker。

1-3 and 5-10:Positive plants of ZY1;4:Negative plant of ZY1;11,12,14,15 and 17:Positive plants of CW134;13,16 and 18:Negative plants of CW134; M:DL2000 DNA marker.

圖3T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果

Fig.3PCRdetectionresultsofT1generationplants

表1 T2代轉(zhuǎn)基因小麥株系的主要農(nóng)藝性狀Table 1 Major agronomic traits of T2 transgenic ZY1 and CW134 lines

*和**分別表示與CK的差異達(dá)到了顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

* and** indicate significant differences between transgenic lines and CK at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.4 TaGAPDH8基因的表達(dá)分析

以T3代轉(zhuǎn)基因小麥的株系為材料提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR鑒定結(jié)果表明，正常生長條件下株系間TaGPDH8基因的表達(dá)水平存在差異。4個長武134株系均表現(xiàn)出較低的表達(dá)量(圖4A)，尤其是CW134-12和CW134-3，TaGAPDH8基因的表達(dá)量僅為對照的21%和53%，表明在這兩個株系中目的基因的表達(dá)受到了較大程度的抑制。在鄭引1號的8個株系中，TaGAPDH8基因的表達(dá)量均高于對照(圖4B)，其中ZY1-10的表達(dá)量最高，ZY1-1次之，分別為對照的3.02和4.02倍。

A:4個干擾表達(dá)株系中TaGPDH8基因的表達(dá)量；B:8個過表達(dá)株系中TaGPDH8基因的表達(dá)量。

A:Relative expression levels ofTaGAPDH8in four RNAi lines;B:Relative expression levels ofTaGAPDH8in eight overexpression lines.

圖4正常生長條件下TaGPDH8基因在小麥株系中的表達(dá)分析

Fig.4TaGAPDH8geneexpressioninwheatlinesundernormalgrowthconditions

3 討 論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速、定向獲得植物新品種，但目標(biāo)基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)卻難以控制。作為六倍體(AABBDD)單子葉植物，小麥具有龐大的基因組和大量的重復(fù)序列，遺傳背景復(fù)雜，轉(zhuǎn)化難度大。研究發(fā)現(xiàn)，外植體的選擇成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化成果與否與的關(guān)鍵,小麥材料的再生效率成為首要的考慮因素。雖然可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的組織有根、成熟胚、花藥、幼穗、幼胚和莖分生組織等多種類型，但幼胚再生性能最好[21]，因此本試驗(yàn)以幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)以長武134和鄭引1號小麥為材料成功獲得遺傳外源基因的轉(zhuǎn)化植株，其T0代植株轉(zhuǎn)化效率分別為0.9%和2.6%，說明轉(zhuǎn)化效率過低的問題仍然存在。這與外植體的基因型、培養(yǎng)基成分、受體預(yù)處理方式和處理時間、受體轟擊后培養(yǎng)及篩選，以及轉(zhuǎn)化條件如微彈種類、直徑大小和用量、轟擊距離和壓力等[22]多種因素相關(guān)?；驑屴D(zhuǎn)化法操作步驟繁瑣，過低的轉(zhuǎn)化率一直是限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。

本實(shí)驗(yàn)對T2代小麥株系進(jìn)行了形態(tài)指標(biāo)測量和基因表達(dá)分析。長武134株系中變化比較明顯的是千粒重，既有顯著降低(P<0.01，CW134-6),也有顯著升高(P<0.01，CW134-12)；而由于鄭引1號株系比較多，其植株的農(nóng)藝性狀差異也更大。造成這種結(jié)果的原因可能與各株系間目的基因的表達(dá)量有所差異，如轉(zhuǎn)化了RNAi載體的株系CW134-12的TaGAPDH8基因的表達(dá)量只有對照的0.21倍，而CW134-13卻高達(dá)0.78倍；轉(zhuǎn)化了過表達(dá)載體的ZY1-1、ZY1-4和ZY1-10的表達(dá)量提高到了2倍以上。造成植株農(nóng)藝性狀和基因表達(dá)量差異的原因有很多，如株系間外源基因拷貝數(shù)、插入位點(diǎn)、大田復(fù)雜的環(huán)境等?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化的植株外源基因拷貝數(shù)多，其隨機(jī)整合的特點(diǎn)使每個株系的基因表達(dá)各有不同，還容易導(dǎo)致外源基因沉默和丟失的情況。如ZY1-3和ZY1-10中TaGAPDH基因的表達(dá)量相差了3.29倍，原因可能是在ZY1-3中外源基因插入的位點(diǎn)在非編碼區(qū)，導(dǎo)致外源基因無法翻譯。因此在以后的試驗(yàn)中需要從這些株系中挑選出具有優(yōu)良性狀的株系進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究了小麥轉(zhuǎn)化體系以及T2代轉(zhuǎn)基因小麥在大田的性狀，得到了與對照植株相比具有明顯差異的株系(表1)。此外，本試驗(yàn)還探究了T3代小麥中TaGAPDH基因的表達(dá)量，證明確實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因株系，如下調(diào)基因表達(dá)的CW134-3和CW134-6及上調(diào)基因表達(dá)的ZY1-1和ZY1-10(圖4)。綜上所述，本試驗(yàn)采用基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的方法成功獲得TaGAPDH8的轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。